Proteomika u mnohočetného myelomu

Mgr. Jana Čumová, Ph.D.

Doctoral thesis

Proteomics of multiple myeloma

Abstract:

Hlavním cílem disertační práce bylo zavedení metodických přístupů k proteomické analýze plazmatických buněk a krevní plazmy pacientů nemocných mnohočetným myelomem se zaměřením na dvourozměrnou gelovou elektroforézu a identifikaci proteinů hmotnostní spektrometrií. Do rutinního provozu byl zaveden separační algoritmus plazmatických buněk ze vzorků kostní dřeně s různou vstupní infiltrací nádorovými plazmatickými buňkami. Jako rozhodovací kritérium pro použití magnetické a fluorescenční separace byla zvolena hodnota procentuálního zastoupení PB v mononukleární frakci pro zisk populace PB o čistotě minimálně 70 %. V první části experimentální práce byla provedena optimalizace solubilizace proteinů v modelovém systému nádorové buněčné linie a separovaných buněk získaných od nemocných MM. Standardní 2-DE metodika byla použita k měření rozdílových proteinových změn buněk linie ARH-77 ovlivněné přídavkem bortezomibu. Dále byla provedena pilotní srovnávací 2-DE analýza proteomu separovaných PB. Hlavním výstupem práce byla identifikace a charakterizace tří proteinů signifikantně zvýšených v buňkách pacientů rezistentních na bortezomib. Analýza proteomu PB provedená pomocí proteomického přístupu kombinace metod SDS-PAGE s analýzou proteinů technikou kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií nám umožnila identifikovat přibližně 3x větší množství proteinů než technika 2-DE. Byli identifikovány proteiny o širokém rozmezí isoelektrického bodu (pI = 4,0 - 11,9) a molekulové hmotnosti (Mr = 3,5 - 331,0 kDa), přičemž proteiny s pI v bazické oblasti (>10) lze velmi obtížně separovat pomocí 2-DE. V rámci optimalizace 2-DE analýz proteinů krevní plazmy byla úspěšně vybrána vhodná metoda frakcionace krevní plazmy umožňující oddělení majoritních proteinů od nízkoabundantní proteinové frakce. Výběr metody se projevil signifikantním zvýšením počtu rozlišitelných proteinových spotů na obrazech 2-DE map. Standardizovaná metodika frakcionace krevní plazmy metodou ProteoMiner s využitím metod 2-DE/MS byla použita pro studium proteinů krevní plazmy pacientů senzitivních a chemorezistentních na podaný bortezomib. Poznatky získané z těchto analýz představují prvotní náhled do biologie plazmatických buněk pacientů nemocných MM. Další analýzy, validace výsledků a zejména funkční studie bude nutné nezbytně provést pro odhalení konkrétní role proteinů v rezistenci buněk na podanou antimyelomovou léčbu.

Abstract:

The main aim of this PhD thesis was establishment of methods for proteomic analysis of plasma cells and blood plasma of multiple myeloma patients aimed at two-dimensional gel electrophoresis and identification by mass spectrometry. Separation algorithm of plasma cells from bone marrow with various entry infiltrations of malignant plasma cells was introduced intro routine operation. As the criteria used for magnetic and fluorescence separation, PC infiltration in mononuclear fraction to ensure gain of PC population of purity at least 70% was chosen.In the first part of the experimental work was carried out the optimization of protein solubility in the model system of tumor cell lines and separated cells of MM patients. Standard 2-DE method was used to measure differences in proteins in the ARH-77 cell line after bortezomib treatment. A pilot comparative 2-DE analysis of proteome of separated PC was performed. The main outcome of this work was identification and characterization of three proteins significantly elevated in patients samples resistant to bortezomib. Analysis of proteome of PC performed by a combination of SDS-PAGE method with protein analysis by liquid chromatography with tandem mass spectrometry allowed us to identify roughly 3 times more proteins than 2-DE method. Proteins of a large range of isoelectric point (pI = 4,0-11,9) and molecular weight (Mr = 3,5 - 331,0 kDa) were identified; proteins with pI in the basic region (>10) are very difficult to separate using 2-DE. We have successfully chosen a suitable method for fractionation of blood plasma allowing for separation of major proteins from low-abundant protein fraction. This method allowed for significant increase in the number of distinguishable protein spots in 2-DE map. Standardized methodology of fractionation of blood plasma using ProteoMiner and 2-DE/MS was used for study of proteins in the blood plasma of patients sensitive and chemoresistant to bortezomib. Findings obtained from these analyses are the first insight into the biology of plasma cells of MM patients. Further analyses, validation of results and functional studies will be necessary to clarify the concrete role of proteins in cell resistance resulting from antimyeloma treatment.

Keywords

dvourozměrná gelová elektroforéza, mnohočetný myelom, biomarker, separační techniky, hmotnostní spektrometrie, two dimensional gel electrophoresis, multiple myeloma, separation techniques, mass spectrometry

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 9. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 30. 9. 2011
• Supervisor: prof. MUDr. Roman Hájek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology (4-years) / Oncology