Využití metod molekulární biologie při detekci bakterií v biologických materiálech

RNDr. Michal Slaný, Ph.D.

Disertační práce

The use of molecular based methods for bacterial detection in biological matrices

Anotace:

Obecně jsou používána dvě schémata pro bakteriální detekci pomocí zvoleného přístupu. První schéma je založené na sekvenční analýze genu 16S rRNA v DNA vzorku izolovaného přímo z biologického materiálu, což vede k výraznému snížení celkové doby analýzy vzorku. Druhé schéma je založené na přípravě bakteriálního izolátu pomocí kultivačních technik a jeho následné identifikaci pomocí sekvenční analýzy16S rRNA. Disertační práce si kladla tři cíle: 1) Zjistit nejčastějšího bakteriálního původce infekční endokarditidy (IE) u klinických vzorků analyzovaných v letech 2003 až 2005 v laboratoři Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno pomocí přímé detekce v biologickém materiálu bez nutnosti provést kultivaci; 2) Aplikovat konvenční širokospektrou 16S rRNA PCR s následnou sekvenční analýzou na identifikaci bakterií v izolátech získaných kultivací z biologických materiálů; a 3) Zavést novou, potenciálně využitelnou, metodu molekulární detekce bakterií. Bakteriální detekce přímo z biologického materiálu byla aplikována v první části práce, kdy byla analyzována skupina 42 pacientů s diagnostikovanou IE a jako nejčastější původce onemocnění byl odhalen Staphylococcus aureus. Výhody molekulární detekce podle tohoto schéma dokumentuje záchyt kultivačně negativního případu Aerococcus urinae. V rámci druhého cíle byl vyšetřen soubor 272 netuberkulózních mykobakteriálních izolátů pocházejících ze vzorků lidí, zvířat a prostředí. Výhody použití sekvenční analýzy genu 16S rRNA aplikované na bakteriální kultury jsou dokumentovány na zpětné identifikaci izolátů Mycobacterium arupense získaných před jeho charakterizací v roce 2006. Použití sekvenční analýzy pro identifikaci bakterií není vždy úspěšné, proto byla jako možná alternativa řešící tyto situace vybrána a zavedena širokospektrá 16S rRNA real time PCR s následnou vysokorozlišovací analýzou teploty taní (HRMA). Bakteriální DNA izolovaná z 12 vybraných sbírkových kmenů zástupců rodu Staphylococcus byla analyzována pomocí 16S rRNA HRMA. Získané 16S rRNA HRMA profily sloužily k rozlišení 10 referenčních kmenů. Z toho dva kmeny bylo možno rozlišit přímo pomocí 16S rRNA HRMA profilů. Zbytek sbírkových kmenů byl rozlišen pomocí 16S rRNA HRMA profilů získaných z tvorby heteroduplexů mezi PCR produktem z testovaného kmene a PCR produktem z referenčního fylogeneticky nepříbuzného kmene. Vyvinutý systém je zatím v důsledku technického omezení možno aplikovat pouze na bakteriální kultury, případné na biologický materiál (krev, punktát) obsahující více než 104 CFU/ml bakterií ve vzorku. V důsledku sekvenční intradruhové variability je metoda vhodná spíše pro potřeby rozlišení kmenů, než pro identifikaci bakterií.

Abstract:

Generally, two schemes for bacterial detection according selected approach are used. Fist one is based upon sequence analysis of bacterial isolate obtained by classical microbiological techniques. Second scheme is applied for universal bacterial 16S rRNA detection directly in biological material and without a need for cultivation. The doctoral thesis proposed three goals: 1) to find out the most frequent bacterial pathogen in IE cases of Infective Endocariditis (IE) collected from years 2003 to 2005 at Centre for Cardiovascular Surgery and Transplantations by use of direct detection in biological matrices without a need for bacterial cultivation; 2) to apply conventional broad range 16S rRNA PCR followed with sequence analysis for identification of bacterial isolates obtained by cultivation from biological material; 3) to select a new potentially suitable method from bacterial detection. Broad range detection of 16S rRNA gene was successfully applied. Bacterial detection directly from biological material was applied in the first part of the thesis. Forty-two patients with diagnosed definite IE were analyzed. The most frequent causal agent was identified Staphylococcus aureus. The advantage of molecular detection according to this scheme is supported by cultivation negative case of Aerococcus urinae. According to the second scheme 272 non-tuberculous mycobacterial isolates derived from humans, animals and environment were analyzed. Advantage of this approach is documented by identification of Mycobacterium arupense in isolates obtained before its discovery and characterization. Broad range 16S rRNA real time PCR followed with high resolution melting analysis (HRMA) was designed for rapid and accurate identification of Staphylococcus spp. The aim of this study was to test a potential of HRMA to distinguish particular bacterial species within Staphylococcus spp. even if using broad-range PCR within the 16 rRNA where sequence differences are minimal. Genomic DNA samples isolated from 12 reference staphylococcal strains were subjected to a real-time amplification of the 16S rRNA gene followed by HRMA. Melting profiles were used as molecular fingerprints for bacterial species identification. Evaluated system was reproducible and able to distinguish 10 reference strains. Two strains were identified directly using melting profiles, other 10 strains were determined via high-resolution plots obtained by heteroduplex formation between PCR products of the tested strain and reference phylogenetically unrelated strain.

Klíčová slova

bakteriální onemocnění, infekční endokarditida, mykobakteriózy, molekulární detekce

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 17. 3. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 15. 4. 2011
• Vedoucí: doc. MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D.

Masarykova univerzita

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Lékařská biologie (čtyřleté) / Lékařská biologie