DNA Replication and Cancer

Mgr. Dávid LUKÁČ

Doctoral thesis

Abstract:

DNA replication is an essential process for duplicating the genome during cell division with precise regulation to prevent genomic instability. DNA replication proceeds bi-directionally, with the leading strand synthesized continuously by DNA polymerase, and the lagging strand synthesized discontinuously by DNA polymerase in the form of short fragments known as Okazaki fragments.The lagging strand synthesis has been identified as a targetable vulnerability in cancer cells, as evidenced by several studies. It has been hypothesized that Okazaki fragments processing might be a limiting factor in the PARP-inhibitor induced replication fork acceleration. To test this hypothesis, emetine, a compound reported as a specific lagging strand synthesis inhibitor, was employed. However, it was observed that emetine does not exclusively target lagging strand synthesis, rather it inhibits DNA replication on both leading and lagging strand. Emetine does not cause strand uncoupling, as indicated by the absence of ssDNA formation and lack of RPA32 accumulation. Furthermore, emetine did not induce DNA damage response or checkpoint activation, suggesting that DNA replication inhibition by emetine is not caused by replication stress. It was demonstrated that emetine´s inhibition of proteosynthesis is the mechanism by which it suppresses DNA replication, rather than specific inhibition of lagging strand synthesis. Poly-(ADP)-ribosylation is a post-translational modification in which chains of poly (ADP-ribose; PAR) are added to proteins by the enzyme (poly (ADP-ribose) polymerase; PARP). In the context of DNA damage, PARylation plays an important role in the cell's response to DNA damage. Research from other groups has indicated that increased PARylation is specifically present during the S-phase at unprocessed Okazaki fragments during DNA replication. Using specific POLA1 inhibitors, such as ADA and CD437, it was observed that S-phase specific PARylation is not reduced but rather increased in response to replication stress caused by strand uncoupling. In line with these findings, mild (low-dose, long-duration) POLA1 inhibition resulted in strand uncoupling together with decrease of PARylation without triggering DNA damage response, suggesting that lagging strand synthesis could be specifically inhibited without inducing replication stress. Additionally, the depletion of POLA1 did not decrease PARylation; however, a subset of cells exhibited significantly higher PARylation and yH2AX phosphorylation. Excluding these high-signal cells confirmed a reduction in the S-phase specific PARylation after POLA1 depletion. Finally, it was proposed that for specifically investigating lagging strand synthesis inhibition, mild POLA1 inhibition is the best alternative, as emetine inhibits DNA replication primarily by preceding proteosynthesis inhibition rather than targeting lagging strand synthesis specifically.

Abstract:

Replikácia DNA je kľučový proces duplikácie bunkového genómu počas bunkového delenia, za prísnej regulácie aby sa predišlo genómovej nestabilite. Replikácia DNA prebieha obojsmerne, pričom vedúce vlákno je syntetizované nepretržite pomocou DNA polymerázy , a zaostávajúce vlákno je syntetizované prerušovane pomocou DNA polymerázy vo forme krátkych fragmentov známych ako fragmenty Okazakiových. Syntéza zaostávajúceho vlákna bola identifikovaná ako cieliteľná slabina v rakovinových bunkách, čo potvrdzujú viaceré štúdie. Predpokladalo sa, že spracovanie Okazakiho fragmentov môže byť limitujúcim faktorom pri zrýchlení DNA replikácie indukovanej PARP inhibítormi. K otestovaniu tejto hypotézy bol použitý emetín, zlúčenina, ktorá bola označená ako špecifický inhibítor syntézy zaostávajúceho vlákna. Zistilo sa, že emetín nezasahuje výlučne do syntézy zaostávajúceho vlákna, ale inhibuje replikáciu DNA na vedúcom aj zaostávajúcom vlákne. Emetín nespôsobuje oddelenie vedúceho a zaostávajúceho vlákna, čo naznačuje absencia tvorby jednovláknovej DNA bez prítomnosti RPA32 akumulácie. Emetín neindukoval odpoveď na poškodenie DNA ani aktiváciu replikačného kontrolného bodu, čo naznačuje, že inhibícia DNA replikácie emetínom nie je spôsobená replikačným stresom. Bolo preukázané, že inhibícia proteosyntézy emetínom je mechanizmom, ktorý predchádza inhibícii replikácie DNA. Poly-(ADP)-ribozylácia je post-translačná modifikácia, pri ktorom sa na proteíny pridávajú reťazce poly (ADP-ribózy; PAR) prostredníctvom enzýmu (poly (ADP-ribóza)polymeráza; PARP). V kontexte poškodenia DNA zohráva PARylácia dôležitú úlohu v odpovedi bunky na poškodenie DNA. Výskum iných skupín naznačil, že zvýšená (PARylácia) je špecificky prítomná počas S-fázy na nespracovaných Okazakiho fragmentoch počas DNA replikácie. Pomocou špecifických inhibítorov POLA1, ako sú ADA a CD437, sa pozorovalo, že špecifická PARylácia v S-fáze sa neznižuje, ale naopak zvyšuje v reakcii na replikačný stres spôsobený oddelením syntézy DNA vlákien. V súlade s týmito zisteniami viedla nízkodávková, dlhodobá inhibícia POLA1 k oddeleniu syntézy DNA vlákien spolu s poklesom PARylácie bez DNA poškodenia, čo naznačuje, že syntéza zaostávajúceho vlákna by mohla byť špecificky inhibovaná bez vyvolania replikačného stresu. Okrem toho, deplécia POLA1 neviedla k celkovému poklesu PARylácie; avšak u podskupiny buniek bola pozorovaná významne vyššia PARylácia a fosforylácia yH2AX. Vylúčenie týchto buniek s vysokým signálom potvrdilo zníženie špecifickej PARylácie v S-fáze po deplécii POLA1. Bolo navrhnuté, že na špecifické skúmanie inhibície syntézy zaostávajúceho vlákna je najlepšou alternatívou nízkodávková, dlhodobá inhibícia POLA1, keďže emetín inhibuje replikáciu DNA predovšetkým inhibíciou proteosyntézy, skôr než špecificky cielením na syntézu zaostávajúceho vlákna.

Keywords

emetín, replikácia DNA, odpojenie vlákien, PARylácia, syntéza zaostávajúceho vlákna

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 12. 2024

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Pavel Moudrý, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Genetics / Medical Genetics