Polyklonální protilátky pro detekci specifických antigenů nádorových buněk

Dana Tůmová

Master's thesis

Polyclonal antibodies for the detection of specific antigens of tumor cells

Abstract:

Cílem diplomové práce bylo ověřit možnost přípravy polyklonálních protilátek ve slepičích vejcích, jejich izolaci z vaječného žloutku a následné otestování v diagnostickém testu. Výhoda polyklonálních protilátek oproti monoklonálním spočívá v jednodušší a méně nákladné přípravě. Polyklonální protilátky se připravují imunizací zvířat vybraným antigenem, pro imunizaci se nejvíce využívá králík a myši, v menší míře jsou využívána i další zvířata. Pro přípravu slepičích polyklonálních protilátek byl použit slepičí model chovaný na pracovišti Ústavu molekulární genetiky v Kolči, do imunizace byly zařazeny roční slepice v plné snášce. Slepice byly imunizovány vybranými antigeny TEAD2 a ETV4. Imunizace probíhala ve dvou měsíčních cyklech a po té vždy následoval sběr vajec a odběr krve na sérum. Vrchol tvorby protilátek je asi čtvrtý den od poslední imunizace a od toho se také odvíjel sběr vajec a odběr krve na sérum. Krevní séra byla otestována na přítomnost protilátek pomocí imunocytochemie, ale tento test přítomnost protilátek nepotvrdil, což mohlo být dáno strukturou sér, kdy se krev na séra hůře srážela a obsahovala velké množství lipidů. Izolace protilátek IgY z vaječného žloutku byla provedena precipitací pomocí polyethylenglykolu PEG 6000, izolované protilátky byly otestovány metodou Western blot, kde se specificky projevila jedna protilátka TEAD6065, která detekovala i endogenní expresi proteinu v buňkách. Ostatní protilátky detekovaly protein pouze v buňkách, kde byl nadměrně exprimován. Nejdůležitější pro potvrzení specifity protilátek bylo jejich otestování pomocí imunohistochemie na parafínových histologických řezech. Na histologických řezech se specificky potvrdila opět protilátka TEAD6065, ostatní protilátky vykazovaly nespecifické barvení buněk. Protilátka TEAD6065 v obou testech potvrdila svou specifitu proti antigenu TEAD2.

Abstract:

The aim of the thesis was to evaluate the possibility of preparing polyclonal antibodies in chicken eggs, their isolation from the egg yolk and subsequent testing in a diagnostic test.The advantage compared to polyclonal antibodies, monoclonal involves simpler and less expensive to prepare. Polyclonal antibodies are prepared by immunizing an animal with a selected antigen for the immunization of the rabbit and used most mice, to a lesser extent are used by other animals.For the preparation of chicken polyclonal antibodies were used chicken behavior model on the Institute of Molecular Genetics, in Koleč, were placed in full annual hens lay. Hens were immunized with the selected antigen TEAD2 and ETV4. Immunization was carried out in two monthly cycles and then always follow egg collection and the collection of blood serum. The peak of antibody production is about four days after the last immunization and since it is also unfolded egg collection and the collection of blood serum. The sera were tested for the presence of antibodies by immunocytochemistry, but this test confirmed the presence of antibodies, which could be due to the structure of serum when blood serum to less clotted and contained a large amount of lipids.Isolation of IgY antibodies from egg yolk by precipitation with polyethylene glycol PEG 6000, an isolated antibody were tested by Western blot, wherein the antibody specifically manifested one TEAD6065 to detect both endogenous protein expression in cells. Other protein antibodies were detected only in cells where the overexpressed. Most important to confirm the specificity of the antibody was their testing by immunohistochemistry on paraffin histological sections. On histological sections specifically confirmed again TEAD6065 antibody, other antibody showed unspecific staining cells. Antibody TEAD6065 both tests confirmed its specificity to the antigen TEAD2.

Keywords

kuřecí polyklonální protilátky, specifické antigeny, nádorové buňky

Keywords

chicken polyclonal antibodies, specific antigens, tumor cells

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 4. 2017

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Lukáš Zita, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Animal Science / Special Animal Raising