Testování citlivosti kryptických druhů aspergilů ze sekcí Fumigati a Nidulantes mikrodilučními standardizovanými metodami

RNDr. Pavlína LYSKOVÁ

Doctoral thesis

Abstract:

Aspergilóza je nejfrekventovanější systémovou infekcí vyvolanou vláknitými houbami a jejím nejčastějším etiologickým agens je A. fumigatus sensu stricto. Dalšími obvyklejšími původci humánních mykóz jsou A. nidulans, A. flavus, A. niger a A. terreus. Z taxonomického hlediska nejsou uvedené druhy samostatné, ale řadí se do sekcí (Fumigati, Nidulantes, Flavi, Nigri, Terrei), v nichž představují nečastější zástupce. V klinických vzorcích však mohou být přítomny kmeny, které morfologicky vypadají identicky, ve skutečnosti se však jedná o jiné druhy. Bývají označovány jako kryptické a v rutinních mykologických laboratořích jsou pomocí běžných identifikačních postupů, založených na morfologických znacích, velmi často nesprávně identifikovány. Důsledkem může být nezjištění jejich rezistence k antimykotikům, což je časté zejména v sekci Fumigati (např. u druhového komplexu A. viridinutans, A. lentulus, A. udagawae). Cílem předložené dizertační práce bylo zjistit antifungální profil testovaných kmenů pomocí standardizované metodiky a porovnat s komerční soupravou YO. Studováno bylo celkem 171 kmenů aspergilů sekce Fumigati (n=90) a Nidulantes (n=81), převážně kryptických druhů, jejichž identifikace byla ověřena molekulárně-genetickými metodami. Bylo provedeno testování citlivosti k AMB, VRC, ITC, POS a echinokandinům pomocí standardizované metodiky EUCAST a komerční diagnostické soupravy YO. Byly stanoveny MIC uvedených antimykotik a procentuální shoda obou metod. Většina zástupců sekce Fumigati, zejména komplexu A. viridinutans, vykazovala zvýšené hodnoty MIC k ITC a VRC, míra in vitro rezistence k AMB byla variabilní. Naopak k POS a echinokandinům byly izoláty obvykle dobře citlivé. Celkový antifungální profil se mezi jednotlivými druhy výrazně lišil a rovněž vnitrodruhová variabilita byla poměrně vysoká. Shoda MIC mezi EUCAST a YO byla u všech ATM poměrně vysoká, zejména v případě klinicky významných druhů (A. felis, A. udagawae a A. pseudoviridinutans). Důležitým zjištěním byla skutečnost, že YO často neodhalila zvýšené MIC k ITC. Všichni testovaní zástupci sekce Nidulantes obvykle vykazovali poměrně nízké hodnoty MIC ke všem testovaným azolovým ATM. V případě AMB měly kryptické druhy této sekce obvykle nižší hodnoty MIC v porovnání s A. nidulans sensu stricto. Shoda EUCAST a YO byla poměrně vysoká pro azolová antimykotika. U zástupců obou testovaných sekcí bylo dosaženo lepší shody po 72 než 48 h. Z výsledků vyplývá, že vzhledem ke zjištěné vysoké vnitrodruhové variabilitě MIC aspergilů z komplexu viridinutans je nezbytné pro jejich stanovení používat spolehlivé metody, které dokáží odhalit častou rezistenci k systémovým ATM. Výsledky hodnocení citlivosti in vitro jsou proto u těchto izolátů v podstatě důležitější než správná druhová identifikace. V případě sekce Nidulantes se většina testovaných zástupců kryptických druhů vyznačovala spíše srovnatelnými nebo dokonce nižšími hodnotami MIC v porovnání s hlavním představitelem, proto se jejich neodhalení nejeví jako zásadní problém.

Abstract:

Aspergillosis is the most common systemic infection caused by filamentous fungi, and the most common etiologic agent is A. fumigatus sensu stricto. Other species frequently causing human infections are A. flavus, A. nidulans, A. niger and A. terreus. Taxonomically, these species do not stand alone but are classified into sections (Fumigati, Nidulantes, Flavi, Nigri, Terrei) in which they are the most common representatives. In clinical specimens, however, strains may be present that morphologically appear to be identical but they actually belong to different species. These are called cryptic species and are very often misidentified using conventional morphological identification techniques. As a result, their antifungal resistance may not be detected, as frequently seen in the section Fumigati (e.g. A. viridinutans species complex, A. lentulus, A. udagawae). The aim of the study was to determine the antifungal profile of the tested strains using standardized methodology and to compare it with the commercial kit YO. A total of 171 Aspergillus strains were studied, predominantly cryptic agents from the sections Fumigati (n = 90) and Nidulantes (n = 81), whose identification was confirmed by molecular-genetic methods. Susceptibility to AMB, VRC, ITC, POS and echinocandins was tested in accordance with the EUCAST standardized methodology and with the YO commercial panel. MICs for the above antifungals were determined and percentage agreement for the two methods was calculated. Most isolates from the section Fumigati, in particular A. viridinutans species complex, demonstrated elevated MICs for ITC and VRC, in vitro resistance to AMB was variable. In contrast, the isolates mostly showed good susceptibility to POS and echinocandins. There were considerable differences in the overall antifungal profile between the species, and intraspecific variation was relatively high. The agreement between the YO and the EUCAST method was high, especially for clinically important species (A. felis, A. udagawae, and A. pseudoviridinutans). Importantly, however, the YO frequently failed to detect elevated MICs of ITC. All the tested strains from the section Nidulantes usually exhibited relatively low MIC values for all azole antifungals. Concerning AMB, cryptic species from the section typically had lower MICs compared to A. nidulans sensu stricto. The agreement between the YO and EUCAST was relatively high for azole antifungals. For both sections, better agreement was observed after 72 hours than after 48 hours. The result suggest that given the detected high intraspecific variability in MICs for strains from the A. viridinutans species complex, reliable methods for MIC determination able to reveal early resistance to systemic antifungals are needed. Therefore, in vitro susceptibility testing results are more important than correct species identification in case of these isolates. Since most of the tested cryptic species from the section Nidulantes showed comparable or even lower MIC values compared to the main representative, the failure to detect them does not seem to be a major problem.

Keywords

Aspergillus, kryptické druhy, EUCAST, Sensititre YestOne, amfotericin B, vorikonazol, itrakonazol, posakonazol

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 3. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 20. 6. 2019
• Supervisor: doc. MUDr. Petr Hamal, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Microbiology / Medical Microbiology