Regulace biosyntézy auxinu během embryogeneze Aradopsis

Bc. Daniel Novák

Master's thesis

Regulation of Auxin Biosynthesis during Arabidopsis embryogenesis

Abstract:

Abstrakt Rostlinný hormon auxin je klíčovým faktorem, který reguluje široké spektrum důležitých procesů během života rostlin. Auxin řídí formování vodivých pletiv, listů a laterálních kořenů, růst stonku a také vývoj rostlinných embryí (Thiman, 1938). Během procesu embryogeneze je místní a časová produkce auxinu ovlivňována dalším významným rostlinným hormonem, cytokininem. Vzájemná kooperace těchto dvou hormonů je považována za podstatu pro formování a vývoj rostlinného embrya. Pro pochopení podstaty, jak je produkce auxinu během embryogeneze regulována cytokininem, jsem provedl analýzu jedinců s mutací ztráty funkce genů pro biosyntézu cytokininu. Mým úkolem také bylo vytvořit značené linie pro geny spojené s metabolismem cytokininu, které byly identifikovány v rámci in silico experimentů a tak moci pozorovat jejich efekt na vývoj embrya. Abych naplnil tyto cíle, provedl jsem celou řadu molekulárně biologických metod, jako izolace DNA z rostlinného materiálu, PCR, agarová elektroforéza, LIC klonování, transformace plazmidů, kultivace bakteriálních kultur a transformace pomocí namáčení rostlin (metoda plant dipp). Pro mikroskopování jsem používal Axio Scope A1 Polarized Light Microscope (Zeiss) a také Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss 700. Provedl jsem také křížení rostlin a barvení embryí. Připravil jsem značené cytokininové linie (LOG4, LOG5, CKX6, IPT2 a IPT9). Selekce antibiotiky potvrdily, že všechny bakteriální kultury a také T1 rostliny v sobě nesly T-DNA inzerce. Nicméně se mi nepodařilo genotypizovat T2 rostliny. Tato zjištění, společně s nepozorovanou fluorescencí, naznačují, že T-DNA nebyla pravděpodobně zcela kompletně integrována v genomu rostlin. Také jsem úspěšné připravil a prozkoumal mutantní linie ckx6, log4, log5, log347 a log1234678. V rámci tohoto experimentu jsem nepozoroval žádné defekty ve vývoji takto postižených embryí.

Abstract:

Abstract The plant hormone auxin is a key regulator of a large variety of processes during plant development. It controls vascular tissue formation, leaf and lateral root initiation, stem cells population and also embryo development (Thiman, 1938). During the process of embryogenesis, spatially and temporally-regulated auxin production is affected by another important plant hormone cytokinin. These two hormones´ mutual cooperation is believed to be of importance for embryo patterning and development. To understand how localised embryonic auxin production is regulated by cytokinin, I did an analysis of loss-of-mutations of distinct cytokinin biosynthesis genes. I generated marker lines of cytokinin-related genes, which were identified in silico and observed their effect on embryo development. To fulfil this task, I performed series of molecular biology methods including DNA isolation from plant material, PCR, agarose electrophoresis, LIC cloning, plasmid transformation, bacterial culture cultivation and floral dipping. I also used the Axio Scope A1 Polarized Light Microscope (Zeiss) and the Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss 700. Embryo staining and plants crossing were also performed. I prepared the CK-related marker lines (LOG4, LOG5, CKX6, IPT2 and IPT9). The antibiotic selections proved, that all the bacterial cultures and T1 plants did carry the T-DNA insertions within them. However, I did not manage to genotype the T2 plants. Together with the lack of fluorescence observed, it indicates that the T-DNA was unlikely to be fully integrated into the plant genome. I also successfully prepared and examined the ckx6, log4, log5, log347 and log1234678 mutants. There were not any developmental defects visible in the embryos of these lines.

Keywords

Rostliny, auxin, cytokinin, biosyntéza, embryogeneze, Arabidopsis, mutant, LOG, IPT, CKX, geny Plants, biosynthesis, embryogenesis, genes

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 9. 6. 2016
• Supervisor: Ph.D. Helene Robert Boisivon

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry