Analýza efektu chemické inhibice cyklin dependentních kináz na diferenciaci lidských embryonálních kmenových buněk

Bc. Dáša Doležalová, Ph.D.

Master's thesis

Analysis of effects of inhibition of cyclin dependent kinases on differentiation of human embryonic stem cells

Abstract:

Embryonálne kmeňové bunky majú obrovský diferenciačný potenciál, limitujúcim faktorom pre ich využitie však zostáva nedostatočné poznanie molekulárnych mechanizmov diferenciácie. Ukazuje sa, že molekuly, zúčastňujúce sa primárne regulácie bunkového cyklu (cyklíny, cyklín-dependentné kinázy (CDK) a inhibítory CDK) hrajú dôležitú úlohu aj v procese diferenciácie. Z pohľadu indukcie diferenciácie je pravdepodobne dôležitá G1 fáza bunkového cyklu. Embryonálne kmeňové bunky sa z pohľadu regulácie a dĺžky bunkového cyklu odlišujú od buniek somatických. V ľudských embryonálnych kmeňových bunkách je dĺžka cyklu pomerne krátka vďaka skrátenej dobe trvania G1 fázy (približne 20 % z celkovej dĺžky cyklu). Vyskytuje sa u nich prevažne hyperfosforylovaná (neaktívna) forma pRb a hladina cyklínu E (spolu s CDK 2 sú považované za hlavné regulátory prechodu G1/S) je pomerne vysoká a stála v priebehu cyklu. Aktivita CDK 2 je tak v priebehu cyklu veľmi vysoká. S diferenciáciou embryonálnych kmeňových buniek sa predlžuje trvanie G1 fázy cyklu, objavuje sa hypofosforylovaná (aktívna) forma pRb a začína oscilovať hladina cyklínu E aj aktivita CDK. Mohlo by to znamenať, že ES bunky nemajú funkčnú kanonickú dráhu reštrikčného bodu v G1 fáze ako istej formy ochrany pre diferenciáciou buniek. Diplomová práca sa zaoberala analýzou efektu inhibície cyklín dependentných kináz špecifickými syntetickými inhibítormi na diferenciáciu ľudských embryonálnych kmeňových buniek in vitro. Zo získaných dát na ľudských ES bunkách vyplýva, že aspoň jeden z analyzovaných inhibítorov (Olomoucin II – OC II), spôsobuje diferenciačné zmeny, ktoré sú odlišné od zmien typických pre spontánne diferencujúce bunky (kultivácia bez OC II). Analýza bunkového cyklu ukázala, že hES bunky ošetrené OC II sa kumulujú v G1 ale najmä v G2/M fáze. Analýza aktivity CDK po prídavku OC II potvrdila inhibíciu CDK2, ale aj CDK1 a potenciálne je možné, že OC II inhibuje aj CDK 9 a/alebo CDK 7 (in vitro kinázová esej, Kryštof et al., 2005). Po dlhodobej kultivácii buniek v médiu s 2 µM koncentráciou OC II však bunky diferencovali najmenej do jedného konkrétneho bunkového typu (neurálne bunky) a exprimovali markery Sox 1, Neuro D1 a Nestin, špecifické pre neurodiferenciáciu. Je teda pravdepodobné, že chemická inhibícia CDK diferenciáciu indukuje, nie však nutne mechanizmom asociovaným s predĺžením G1 fázy bunkového cyklu.

Abstract:

Human embryonic stem cells (hESC) are lines of pluripotent cells with the ability to indefinitely self-renew and capacity to differentiate into almost all somatic cell types. Thanks to these characteristics, hESC create new opportunities to both basic research and clinical medicine. Although mechanisms that drive hESC into differentiation are not yet fully understood, it is hypothesized that fast proliferation and limited length of G1 phase contribute to the maintenance of hESC in undifferentiated status. Cyclin-dependent kinsases (CDK), cyclins and inhibitors of CDKs are key regulators of cell cycle progression. The aim of this study was to analyze the effect of inhibition of CDKs with synthetic inhibitors (synthesized in the laboratory of Growth Regulators at Palacky University in Olomouc) on differentiation of hESC (line CCTL -14). The data show that exposure of hESC maintaned under standard nondifferentiating culture conditions to synthetic inhibitor 2,6,9-trisubstituted purine - Olomoucine II (OC II) promotes differentiation changes in such cells. Notably, the changes induced by OC II were different from those observed in spontaneously differentiating hESC. Flow-cytometric analysis of the cell cycle showed that after 5 and/or 24 hour treatment with OC II hESC accumulate not only at G1 but also at G2/M phase of their cell cycle. Correspondingly, immunoprecipitation of CDKs followed by in vitro measurement of their activity have shown that OC II inhibits both CDK 2 and CDK 1. Prolonged cultivation of hESC with OC II in standard culture media have lead to developement of expression of neuro-specific markers Sox1, Neuro D1, and Nestin as determined by RT-PCR and indirect immunofluorescence. We conclude that differentiation of hESC can be induced by inhibition of cyclin dependet kinases but the underlying mechanism might not be associated exclusively with the elongation of the G1 phase of the cell cycle.

Keywords

ľudské embryonálne kmeňové bunky, diferenciácia, bunkový cyklus, inhibítory CDK, Olomoucin II

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 16. 6. 2008
• Supervisor: doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular Biology and Genetics