Ovlivnění mrazitelnosti ejakulátu hřebců s využitím přídavku semenné plazmy a jejích proteinů

Ing. Filipa Bubeníčková

Disertační práce

Effect of the addition of seminal plasma and its proteins on stallion ejaculate freezability

Anotace:

Inseminace mraženou inseminační dávkou patří k nejpoužívanějším metodám asistované reprodukce koní. Kryokonzervace u hřebců a kvalita rozmrazené inseminační dávky je stále problematická. Neexistuje selekce samců na kvalitu ejakulátu a mezi jednotlivými hřebci se vyskytuje značná variabilita v tom, jakou si jejich semeno udržuje fertilizační schopnost po zmrazení a rozmrazení. Ejakulát navíc není homogenní směsí spermií a skládá se z různých subpopulací, jejichž poměr a typ není konzistentní. Znalost typu a složení jednotlivých subpopulací spermií v ejakulátu je možným nástrojem, který pomůže predikovat fertilizační potenciál i mrazitelnost konkrétního samce. Tím pádem znalosti o heterogenitě ejakulátu mohou napomáhat k výběru vhodných metod asistované reprodukce a následně vést k vyšší oplozovací schopnosti a mít tak vliv na ekonomickou složku chovu koní.Při standardní výrobě mražených inseminačních dávek je semenná plazma (SP) odstraněna a nahrazena ředidlem, čímž dochází k výraznému snížení obsahu proteinů SP. Semenná plazma, jako přirozené prostředí pro spermie, obsahuje řadu složek důležitých pro dozrávání spermií a úspěšné oplození oocytu. Proteiny SP fungují jako regulátoři v mnoha fázích zrání spermií a následné fertilizace, díky schopnosti vázat různé ligandy. Mimo jiné jsou proteiny SP zapojeny do přestavby povrchu spermií, ke kterému dochází během transportu spermií skrze samčí i samičí pohlavní trakt a dále přispívají k počátečním a zásadním krokům oplození, např. vytvoření rezervoáru spermií v oviduktu, modulaci kapacitace, akrozomální reakce a interakce gamet. Vliv SP a různých proteinových frakcí SP na mrazitelnost spermií byl pozorován u býků a kanců a zdá se, že semenná plazma obsahuje proteiny jak s negativním, tak i pozitivním vlivem na spermie. Separace a identifikace proteinů SP s ochrannými vlastnostmi může vést k zefektivnění procesu kryokonzervace úpravou složení ředidel, čímž se mnohem lépe zachová fertilizační potenciál kryokonzervovaných spermií hřebců. Podle dostupných zdrojů je hypotézou, že SP od dobře mrazitelných hřebců zlepšuje funkční parametry kryokonzervovaných spermií hřebců, kteří jsou klasifikovaní jako špatně mrazitelní.Pomocí klastrové analýzy hodnot kinematických parametrů rozmrazených spermií byly prokázány významné rozdíly mezi rozložením subpopulací spermií mezi dobře a špatně mrazitelnými hřebci. Experimentálně byl potvrzen pozitivní vliv přídavku SP na některé kinematické parametry spermií špatně mrazitelných hřebců a také na distribuci spermií do subpopulací. Aby se eliminovala variabilita ve složení SP a její možné negativní vlivy, bylo dalším krokem přidání specifických proteinových frakcí SP ke spermiím hřebců před zmrazením. Byl prokázán na koncentraci závislý vliv proteinových frakcí na hřebčí spermie po rozmrazení a to především na kinematické parametry spermií, na rozložení subpopulací a dále také na stav akrozomu.Bylo by užitečné stanovit úrovně vybraných složek SP jako součást šlechtitelské zkoušky hřebců s jinak nevysvětlitelnou neplodností nebo subfertilitou. SP ovlivňuje životnost spermií a zvláště u hřebců produkujících sperma s omezenou tolerancí ke skladování, lze zlepšit kvalitu spermatu modifikací postupů jejich zpracování. V současné době se zdá, že dostupné znalosti o účincích obsahu SP na spermie při konzervaci a na plodnost jsou nejednotné a někdy i konfliktní. To lze považovat za silnou motivaci k dalšímu výzkumu v této oblasti.

Abstract:

Artificial insemination with frozen dose is one of the most widely used methods of assisted reproduction in horses. Achieving successful cryopreservation of spermatozoa is still a challenge as there are considerable differences between sperm freezability due to stallions individuality. In addition, ejaculate is not a homogeneous mixture of sperm and consists of different subpopulations whose ratio and type are not consistent. Knowledge of the type and composition of individual sperm subpopulations in ejaculate is a possible tool that will help predict the fertilization potential and freezability of a particular male. Thus, knowledge of the heterogeneity of ejaculate can help to select appropriate methods of assisted reproduction and subsequently lead to higher fertilization ability and thus have an impact on the economics of horse breeding.In standard frozen insemination dose production, seminal plasma (SP) is removed and replaced with extender, which results in a significant reduction in SP protein content. Seminal plasma is a natural environment for spermatozoa and contains a number of components important for normal fertilization. SP proteins act as regulators in many phases of sperm maturation and subsequent fertilization, due to the ability to bind different ligands. Among other things, they are involved in sperm surface remodeling that occurs during sperm transport through the male and female reproductive tracts. During the sperm maturation process, the spermatozoa acquire the ability to fertilize the oocyte. SP proteins contribute to the initial and fundamental steps of fertilization, such as the formation of a sperm reservoir in the oviduct, modulation of capacitation, acrosomal reaction, and gametes interaction.The effect of SP and various protein fractions of SP on sperm freezability was observed in bulls and boars, and the seminal plasma appears to contain components with negative and also positive effect. Separation and identification of SP proteins with protective properties can lead to more effective cryopreservation by adjusting the diluent composition, thus maintaining the fertilization potential of cryopreserved stallion sperm. One hypothesis, according to the available information, is that SP from good-freezing stallions improves the parameters of cryopreserved sperm from stallions that are poor-freezers. Using cluster analysis of the values of the kinematic parameters of frozen-thawed stallion sperm were demonstrated significant differences in the distribution of sperm subpopulations between good and poor freezers. The positive effect of SP addition on some motility parameters of poorly freezing stallions and also on the distribution of sperm into subpopulations was experimentally confirmed. The next step was to add specific SP protein fractions to stallion sperm before freezing to eliminate SP composition variability and its possible negative effects. The concentration-dependent effect of protein fractions on stallion sperm after thawing was demonstrated, especially on the kinematic parameters of sperm, on the distribution of subpopulations and also on the acrosomal integrity.It would be useful to determine the levels of selected components of SP as part of a breeding test for stallions with otherwise unexplained infertility or subfertility. SP affects sperm viability, and especially in stallions producing sperm with limited storage tolerance, sperm quality can be improved by modifying existing protocols for sperm cryopreservation. At present, the available knowledge on the effects of SP content on sperm and fertility appears to be inconsistent and sometimes conflicting. This can be considered as a strong motivation for further research in this area.

Klíčová slova

hřebec, kryokonzervace, mrazitelnost, semenná plazma, proteiny semenné plazmy

Keywords

stallion, cryopreservation, freezability, seminal plasma, seminal plasma proteins

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 4. 8. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Ing. Eva Chmelíková, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Doktorský studijní program / obor:
Zootechnika / Obecná zootechnika