Racionální návrh proteinů řízený kinetickými studiemi

RNDr. Martin Toul, Ph.D.

Doctoral thesis

Rational protein design driven by kinetic studies

Abstract:

Kinetická analýza poskytuje cenné informace o jednotlivých krocích a mechanismu biologicky a průmyslově relevantních biomolekul. Důkladná charakterizace zajišťuje lepší pochopení molekulárních principů a identifikaci rychlost limitujícího kroku. Ty jsou základem pro zdokonalování proteinů pomocí metod racionálního proteinového inženýrství. Odstranění limitace a vylepšení celkové efektivity je kritickým předpokladem pro průmyslové využití proteinů, které je jinak neekonomické. Tato práce shrnuje aktuální stav praktického využití proteinů a s tím související problémy. Poskytnut je taktéž přehled dostupných kinetických metod a jejich důležitosti pro proteinové inženýrství. Tento přístup je následně aplikován na tři modelové proteiny: (i) staphylokinasa, klinicky zajímavé trombolytikum aktivující rozpouštění patologických krevních sraženin; (ii) halogenalkandehalogenasy, komerčně využitelné v technologii HaloTag; a (iii) luciferasy, bioluminiscenční enzymy vyzařující viditelné světlo využitelné v diagnostických kitech. Kinetická analýza staphylokinasy odhalila rozšířený mechanismus s dosud necharakterizovanými dráhami a limitacemi, což umožnilo spolehlivé stanovení katalytické aktivity, která byla dosud 10 000x podhodnocována. Odstranění nalezené limitace poskytlo variantu staphylokinasy se sedminásobně zvýšenou afinitou a desetinásobně vylepšenou selektivitou ke svému fyziologickému partnerovi. Charakterizace halogenalkandehalogenas odhalila, že mutace katalytického rezidua histidin v technologii HaloTag by měla být provedena za asparagin pro dostatečně efektivní a nevratné značení. Výzkum luciferas vedl k popsání kompletního katalytického mechanismu, který probíhá skrze superoxidový radikálový meziprodukt a vyžaduje (de)protonační kroky substrátu i produktu. Srovnání kinetických parametrů různých variant luciferas potvrdilo, že flexibilní oblasti jsou nezbytné pro efektivní vazbu substrátu a bioluminiscenci. Inženýrství těchto dynamických částí poskytlo luciferasu se zvýšenou afinitou k substrátu, minimalizovanou produktovou inhibicí a stonásobně prodlouženou emisí viditelného světla. Všechny výsledky zde prezentované kinetické analýzy nabízejí lepší pochopení proteinů s ohledem na strukturně-funkční vztahy pro jejich vylepšování pomocí strategie racionálního designu. Nově vytvořené varianty jsou zároveň atraktivními proteiny pro budoucí biotechnologické aplikace.

Abstract:

Kinetic analysis is a powerful tool providing invaluable information about individual steps and the mechanism of biologically and industrially relevant biomolecules. Rigorous characterization ensures better understanding of the molecular principles and identification of the rate-limiting step. This is an essential base for proteins improvement by the rational protein engineering approach. Removing the major bottleneck and enhancing the overall effectivity is the critical prerequisite for proteins industrial application which is otherwise hardly profitable. This thesis summarizes the current status of proteins application and the accompanying challenges. Available methods of kinetic analysis and their importance for protein engineering are further provided. This approach is applied to three model proteins: (i) staphylokinase, clinically interesting thrombolytic protein activating cleavage of pathological blood clots; (ii) haloalkane dehalogenases, commercially utilized in the HaloTag label technology; and (iii) luciferases, bioluminescent enzymes emitting visible light implemented in diagnostics. Kinetic analysis of staphylokinase provided an extended mechanism with not yet characterized off-pathways and limitations, allowing the determination of reliable catalytic activity value previously underestimated by the factor of 10,000. Removal of the identified limitation provided a staphylokinase variant with 7-fold improved affinity and 10-fold improved selectivity towards its physiological partner. Characterization of haloalkane dehalogenases revealed that the catalytic histidine mutation in the HaloTag technology should be substituted with asparagine to yield effective, highly irreversible labeling. Finally, investigation of Renilla-type luciferases allowed deciphering their catalytic mechanism which proceeds via a superoxide radical and requires (de)protonation events during the catalytic cycle. A comparison of luciferase variants kinetic parameters confirmed that the flexible regions are essential for effective substrate binding and light emission. Engineering these dynamic elements provided a luciferase with increased substrate affinity, minimized product inhibition, and a 100-fold prolonged half-life of the emitted light. Collectively, the herein presented results of the kinetic analysis provide understanding of proteins structure-function relationship and essential information for their improvement using the rational design approach. The generated variants represent attractive proteins for biotechnological application

Keywords

proteinové inženýrství, enzymová kinetika, steady-state a pre-steady-state, tranzitní kinetika, rychlost-limitující krok, staphylokinasa, luciferasa, halogenalkandehalogenasa, průmyslová aplikace, protein engineering, enzyme kinetics, steady-state and pre-steady-state, transient kinetics, rate-limiting step, staphylokinase, luciferase, haloalkane dehalogenase, industrial application

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 3. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 12. 5. 2023
• Supervisor: prof. RNDr. Zbyněk Prokop, Ph.D.
• Reader: Assoc. Prof. Per-Olof Syrén, Prof. Marco Fraaije

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Molecular and Cell Biology and Genetics / Molecular and Cell Biology and Genetics