Protein structure and function studied by NMR spectroscopy and MD simulations

Mgr. Pavel Macek, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Rentgenová difrakce a nukleární magnetická resonance (NMR) jsou dvě hlavní techniky používané pro určování struktury makromolekul na atomární úrovni. V mnoha případech je funkce makromolekul závislá na tranzitním stavu. V těchto případech je dynamický popis nezbytný k pochopení funkce molekuly. NMR a molekulárně dynamické (MD) simulace jsou techniky používané k propojení statické struktury a dynamiky nutné pro funkci makromolekul. Tato práce byla zaměřena na vyřešení struktury Mason-Pfizer opičího viru pomocí NMR spektroskopie a na interpretaci rozdílů v NMR dynamických parametrech mezi APO- a HOLO- (s navázaným proteinem) formou hlavního myšího proteinu-I na atomární úrovni pomocí MD simulací. Pomocí NMR byla vyřešena struktura s vysokým rozlišením N-terminální domény (NTD) retrovirálního kapsidového proteinu (CA) z Mason-Pfizerova opičího viru (M-PMV), patřícího do druhu Betaretrovirů. Struktura M-PMV NTD CA je podobná strukturám ostatních retrovirálních kapsid a je charakterizována svazkem šesti alfa-helixů a N-terminální vlásenkou, která je stabilizována interakcí mezi vysoce konzervovanými residui, Pro1 a Asp57. Vzhledem k tomu, že byla prokázána kritická role beta-vlásenky pro formaci infekčního virového jádra, byla zkoumána funkce M-PMV beta-vlásenky dvou mutantů, dP1NTDCA a D57NTDCA, v nichž byl narušen solný můstek stabilizující strukturu divokého typu. NMR data získaná pro tyto dva mutanty byla porovnána s daty divokého typu. Hlavní strukturní změny byly pozorovány v beta-vlásence, v helixech 2, 3 a 5, a ve smyčce spojující helixy 2 a 3. Tato pozorování jsou podpořeny biochemickými daty která ukazují rozdílné štěpení mezi divokým typem a mutovaným kapsid-nukleokapsid fůzním proteinem (CANC) pomocí M-PMV proteasy. Navzdory strukturním změnám jsou mutanty s narušeným solným můstkem schopny se poskládat do nezralé sférické částice. Tato pozorování potvrzují, že vzájemná interakce a topologie mezi beta-vlásenkou a helixem 3 může korelovat se změnami v interakcích mezi nezralým a zralým uspořádáním. Molekulární vibrace volné a vázané formy myšího močového proteinu-I dříve stanovené pomocí měření NMR relaxací byly simulovány pomocí MD po dobu 30ns. Ohebnost páteře byla popsána na základě parametru uspořádání běžně používaného při interpretaci NMR relaxací. Pozornost byla věnována vlivu konformační výměny při nanosekundové časové škále. Pro rozlišení pohybů na odlišných časových škálách byly vypočítány časově závislé parametry uspořádání. Byl aplikován alternativní způsob určení pomalé konformační výměny na základě variance torzních úhlů páteře. Pro dobře definované konformační stavy byly vypočítány konformačně filtrované parametry uspořádání. Srovnání dat získaných pro apo formu a formu s navázaným feromonem se ukázalo, že některá residua jsou více rigidní ve vázané formě, nicméně větší část proteinu svou ohebnost zvýší po navázání feromonu. Tyto výsledky jsou v souladu s NMR experimentem. Zvýšená ohebnost pozorovaná na (fs-ps) časové škále byla typicky pozorována u aminokyselinových zbytků s vyšší konformační volností na ns časové škále. Na atomární úrovni jsou zmeny v ohybnosti vysvětleny rozdílným uspořádáním vodíkových vazeb mezi apo formou a formou s navázaným feromonem.

Abstract:

X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance (NMR) are two main techniques used for determining the structures of macromolecules at atomic level. However, in many cases the macromolecular function is dependent on transition state adapted from ground state by conformational rearrangement. In such cases the dynamic description is necessary for the understanding of the molecular function. NMR and molecular dynamics (MD) simulations are techniques used to bridge the static structure and dynamics dependent function of macromolecules. This work was focused on the solving the solution structure of the Mason-Pfizer monkey virus using the NMR spectroscopy and on interpreting the difference of NMR derived dynamic parameters between the APO- and HOLO- (ligand-bound) form of mouse major urinary protein-I on atomic level using MD simulations. The high resolution structure of the N-terminal domain (NTD) of the retroviral capsid protein (CA) of Mason-Pfizer monkey virus (M-PMV), a member of Betaretroviruses family, has been determined by NMR. The M-PMV NTD CA structure is similar to the other retroviral capsid structures and is characterized by a six-alpha- helical bundle and an N-terminal beta-hairpin, stabilized by an interaction of highly conserved residues, Pro1 and Asp57. Since the role of the beta-hairpin has been shown to be critical for formation of infectious viral core, we also investigated the functional role of M-PMV beta-hairpin in two mutants, i.e., dP1NTDCA, and D57ANTDCA, where the salt bridge stabilizing the wild-type structure was disrupted. NMR data obtained for these mutants were compared to that for the wild-type. The main structural changes were observed within the beta-hairpin structure, within helices 2, 3 and 5, and in the loop connecting helices 2-3. This observation is supported by bio- chemical data showing a different cleavage pattern of the wild-type and the mutated capsid-nucleocapsid fusion protein (CANC) by MPMV protease. Despite these structural changes, the mutants with the disrupted salt-bridge are still able to assemble into immature, spherical particles. This confirms that the mutual interaction and topology within the beta-hairpin and helix 3 might correlate with the changes of interaction between immature and mature lattice. Molecular motions of free and pheromone-bound mouse major urinary protein I, previously investigated by NMR relaxation, were simulated in 30 ns MD runs. The backbone exibility was described in terms of order parameters and correlation times, commonly used in the NMR relaxation analysis. Special attention was paid to the effect of conformational changes on the nanosecond time scale. Time dependent order parameters were determined in order to separate motions occurring on different time scales. As an alternative approach, slow conformational changes were identified from the backbone torsion angle variances, and conformationally filtered order parameters were calculated for well-defined conformation states. A comparison of the data obtained for the free and pheromone-bound protein showed that some residues are more rigid in the bound form, but a larger portion of the protein becomes more exible upon the pheromone binding. This finding is in general agreement with the NMR results. The higher exibility observed on the fast (fs-ps) time scale was typically observed for the residues exhibiting higher conformational freedom on the ns time scale. An inspection of the hydrogen bond network provided a structural explanation for the exibility differences between the free and pheromone-bound proteins in the simulations

Keywords

Nukleární Magnerická Resonance, protein, Molekulání Dynamika

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 8. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 24. 9. 2009
• Supervisor: prof. RNDr. Vladimír Sklenář, DrSc.
• Reader: doc. Ing. Richard Hrabal, CSc., RNDr. Jiří Vondrášek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biomolecular Chemistry