Analýza buněčných antigenů u leukémií – ROR1 a COBLL1 u chronické lymfocytární leukémie

Mgr. Hana Plešingerová, Ph.D.

Doctoral thesis

Analysis of cell antigens in leukemias – ROR1 and COBLL1 in chronic lymphocytic leukemia

Abstract:

Úvod: Chronická lymfocytární leukémie (CLL) je maligní onemocnění B lymfocytů, jejichž přežití závisí na signálech poskytovaných mikroprostředím. Maligní B lymfocyty se odlišují od zdravých povrchovou expresí tyrozin kinázy ROR1, která aktivuje signální dráhu Wnt/PCP (planar cell polarity) regulující migraci buněk CLL. Prognóza pacientů s CLL je značně variabilní a určuje se zejména dle přítomnosti somatických hypermutací v IGHV (variabilní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu) a aberací v genu TP53 (delece či mutace). Cílem práce bylo potvrdit vazbu ROR1 a jeho nově identifikovaného partnera COBLL1 a vyšetřit vztah exprese genu COBLL1 k prognóze pacientů s CLL a chování maligních buněk. Metody: Vazby proteinů byly analyzovány za použití transfekce buněk HEK293 vektory kódujícími COBLL1 a ROR1 a následné imunoprecipitace a imunofluorescenčního barvení. Exprese byla hodnocena kvantitativní RT-PCR a westernovým přenosem. Celkové přežití pacientů (OS) a jejich čas do první a druhé terapie (TTFT, TTST) byly porovnávány dle Kaplan-Meierových křivek. Odpověď na stimulaci BCR byla hodnocena jako nárůst fosforylace proteinů PLCγ2, SYK a BLNK. Byla sledována migrace do prostředí s chemokiny CXCL12 a CCL19. Výsledky: Prokázali jsme vazbu ROR1 a COBLL1. COBLL1 byl exprimován vyšší měrou u pacientů s CLL a mutovaným IGHV (M-CLL) a u 40 % pacientů s nemutovaným IGHV (U-CLL). Zbývajících 60 % U-CLL pacientů exprimovalo COBLL1 na nižší úrovni. Pacienti s U-CLL s vysokou expresí COBLL1 (COBLL1-vysoký) se vyznačovali výrazně horším přežitím než pacienti s U-CLL s nízkou expresí COBLL1 (COBLL1-nízký). Tento jev byl zachován i při vyloučení pacientů s aberantním TP53. Byla potvrzena nezávislost exprese COBLL1 jakožto prognostického znaku pro celkové přežití pacientů s U-CLL. Pacienti s U-CLL COBLL1-vysoký se v porovnání s ostatními pacienty vyznačovali zvýšenou odpovědí na stimulaci B buněčného receptoru a sníženou chemotaxí za chemokiny CXCL12 a CCL19. Kombinace exprese COBLL1 a dalších dvou prognostických znaků LPL a ZAP70 umožnila zařadit pacienty CLL do skupiny s mutovaným či nemutovaným IGHV. Validace kombinovaného expresního prognostického parametru prokázala jeho vysokou přesnost s ohledem na zařazení do skupiny dle mutačního stavu IGHV (93 %) a stabilitu při progresi onemocnění. Závěr: Exprese genu COBLL1, kódujícího nového vazebného partnera ROR1, identifikuje v kombinaci s mutačním stavem IGHV pacienty s CLL s velmi špatnou prognózou. Tito pacienti – U-CLL COBLL1-vysoký – se dále vyznačují deregulovanou odpovědí na signály přijímané z mikroprostředí. Zároveň lze na základě analýzy exprese COBLL1 spolu s LPL a ZAP70 velmi přesně určit prognózu pacientů s CLL.

Abstract:

Introduction: Chronic lymphocytic leukaemia (CLL) is a disease of malignant B cells dependent on microenvironmenal stimuli. Malignant B lymphocytes differ from healthy B lymphocytes in surface expression of ROR1 – a tyrosine kinase activating signalling Wnt/PCP (planar cell polarity) pathway, which regulates CLL cell migration. To determine heterogeneous prognosis of CLL patients, IGHV SHM status (presence of somatic hypermutation in immunoglobulin heavy chain variable region) and TP53 aberrations (deletion or mutation) are tested. The aim of this thesis was to confirm interaction between ROR1 and its newly identified binding partner COBLL1 and to examine COBLL1 gene expression in relation to CLL patients’ prognosis and CLL cell behaviour. Methods: To analyse protein interactions, HEK293 cells were transfected with vectors coding COBLL1 and ROR1 and subsequently submitted to immunoprecipitation and immunofluorescence staining. The expression was evaluated using qRT-PCR and western blotting. Patients’ overall survival (OS) and their time to first and second treatment (TTFT, TTST) was analysed according to Kaplan-Meier curves. Response to BCR stimulation was evaluated through PLCγ2, SYK and BLNK phosphorylation increase. Migration towards chemokines CXCL12 and CCL19 was analysed. Results: We proved interaction between ROR1 and COBLL1. COBLL1 expression was higher in CLL patients with mutated IGHV (M-CLL) and in 40 % CLL patients with unmutated IGHV (U-CLL). In the remaining 60 % U-CLL patients, lower COBLL1 level was detected. U-CLL patients with high COBLL1 expression (COBLL1-high) showed significantly shorter survival than U-CLL patients with low COBLL1 expression (COBLL1-low). This phenomenon held also after excluding aberrant TP53 patients from the analysis. We proved COBLL1 expression as an independent prognostic marker of U-CLL patients’ overall survival. Compared to other CLL patients, U-CLL COBLL1-high patients exhibited increased response to B cell receptor (BCR) stimulation and impaired chemotaxis towards chemokines CXCL12 and CCL19. Combined with expression of two other prognostic markers LPL and ZAP70, expression of COBLL1 enabled to categorize CLL patients into group with mutated or unmutated IGHV. Validation of combined expression prognostic marker proved its high accuracy to IGHV SHM status determination (93%) and its stability during disease progression. Conclusion: Expression of COBLL1 gene, coding a novel ROR1 binding partner, in combination with IGHV mutational status identifies CLL patients with inferior prognosis. These patients – U-CLL COBLL1-high – show deregulated response to microenvironmental stimuli. Also, CLL patients’ prognosis can be determined according to COBLL1, LPL and ZAP70 expression analysis.

Keywords

chronická lymfocytární leukémie, COBLL1, ROR1, prognóza, nemutovaný IGHV, signální dráha Wnt/PCP, signální dráha BCR, chemotaxe, chronic lymphocytic leukeamia, unmutated IGHV, prognosis, Wnt/PCP signaling pathway, BCR signaling pathway, chemotaxis

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 4. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 25. 5. 2018
• Supervisor: prof. MUDr. Michael Doubek, Ph.D.
• Reader: MUDr. Yvona Brychtová, Ph.D., Mgr. Vítězslav Kříž, Ph.D., RNDr. Filiip Vrbacký, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology (4-years) / Oncology