Vliv inhibice PORCN na chondrogenezi

Bc. Tereza Szotkowská

Master's thesis

Effect of PORCN inhibition on chondrogenesis

Abstract:

Porcupine (PORCN) je membránově vázaný protein endoplazmatického retikula, který zodpovídá za připojení dlouhých řetězců mastných kyselin k WNT proteinům, díky čemuž následně dochází k jejich sekreci a správnému průběhu WNT signalizace. Mutace či ztráta funkce této molekuly vede u postižených jedinců mimo jiné k výrazným skeletálním abnormalitám. Na základě této skutečnosti jsme se rozhodli využít několik modelových systémů, ve kterých jsme analyzovali vliv dvou komerčně dostupných PORCN inhibitorů (C59 a LGK974) na chondrogenezi. K porovnání specifity efektu PORCN inhibitorů jsme rovněž navíc analyzovali inhibitor PF670462, který inhibuje WNT signalizaci potlačením funkce kasein kinázy 1 namísto PORCN. Naše in vitro analýzy kuřecích mikromas kultivovaných s C59 či LGK974 prokázaly zintenzivnění chondrogenních procesů, přičemž se jednalo jak o větší množství kondenzačních center, vyšší produkci ECM, tak i signifikantně zvýšenou expresi klíčových genů provázejících různá stádia chondrogeneze (Sox9, Col2a1, Ihh). Po aplikaci PORCN inhibitorů na kultury myších tibií došlo k výraznému prodloužení délky tibií díky nárůstu chrupavčité tkáně a navazující analýzy prokázaly expanzi hypertrofické a redukci proliferační zóny v růstové ploténce. Podobně jako u mikromas a tibií, vedla kultivace organoidů založených z kuřecích končetinových pupenů po aplikaci LGK974 rovněž k signifikantnímu nárůstu jejich velikosti ve srovnání s kontrolními organoidy. Pro odhalení efektu LGK974 in vivo bylo využito larvální stádium modelového organismu Danio rerio, u kterých jsme po působení inhibitoru pozorovali zkrácení tělní osy a výskyt větších hypertrofických chondrocytů. Naše experimenty využívající celou řadu modelových systémů prokázaly, že PORCN inhibitory mají pozitivní vliv na chondrogenezi, zrychlují diferenciaci chondrocytů a indukují hypertrofii buněk.

Abstract:

Porcupine (PORCN) is a membrane-bound protein of the endoplasmic reticulum. PORCN is responsible for the attachment of long-chain fatty acids to WNT proteins, resulting in their secretion and proper WNT signalling. Mutation or loss of function of this molecule leads to significant skeletal abnormalities in affected individuals. We analysed the effect of two PORCN inhibitors (C59 and LGK974) on chondrogenesis in several model systems. To compare the specificity of the impact of C59 and LGK974 on tissues, we also evaluated the inhibitor PF670462, which inhibits WNT signalling by suppressing the casein kinase-1 function. Our analyses in chicken micromasses treated with PORCN inhibitors determined enhanced chondrogenic processes such as higher ECM production, higher amount of condensation nodules and increased expression of genes crucial for chondrogenesis. Cultures of mouse tibiae displayed a significant increase of cartilaginous tissue after treatment with PORCN inhibitors, the expansion of the hypertrophic zone and the reduction of the proliferation zone. Similar to findings in micromasses and tibiae, organoids cultivated with LGK974 were significantly enlarged when compared to controls. Next, zebrafish larvae were used to reveal the effect of LGK974 on chondrogenesis in vivo. We observed a shortening of the body axis and noticed larger hypertrophic chondrocytes after inhibitor treatment. In conclusion, our experiments using large amount of model systems determined positive effect of PORCN inhibitors on chondrogenesis, the acceleration of chondrocyte differentiation and the induction of cellular hypertrophy.

Keywords

Chondrogeneze, WNT, Porcupine, Endochondrální osifikace, Vývoj končetin, Chondrocyt, Chondrogenesis, Endochondral ossification, Limb development, Chondrocyte

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 22. 6. 2022
• Supervisor: doc. RNDr. Marcela Buchtová, Ph.D.
• Reader: Mgr. Dušan Hrčkulák, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Animal Biology and Immunology / Developmental Biology