HPLC/MS charakterizace regioizomerních směsí triacylglycerolů

Ing. Hana Dvořáková

Disertační práce

HPLC/MS characterization of triacylglycerol regioisomeric mixtures

Anotace:

Disertační práce se zabývá analýzou komplexních směsí triacylglycerolů, které představují významnou součást naší potravy a mají důležitou roli při mnoha biologických procesech v lidském organizmu. Předkládaný text shrnuje výsledky dosažené při separacích a následných identifikacích triacylglycerolů a jejich regioizomerů obsažených v rostlinných olejích, živočišných tucích a randomizačních směsích. Získané výsledky byly uvedeny ve čtyřech publikacích uveřejněných v mezinárodních odborných časopisech. Jednotlivé triacylglyceroly se mezi sebou mohou lišit v mnoha parametrech. Kombinací triacylglycerolů se v přírodě vytvářejí složité směsi, které není možné bez jejich předchozí důkladné separace identifikovat. Za účelem získání maximálního počtu separovaných triacylglycerolů byly optimalizovány chromatografické podmínky v systému argentační chromatografie. Bylo zjištěno, že složení mobilní fáze a délka chromatografické kolony měly významný vliv na účinnost separace triacylglycerolů a především jejich regioizomerů. V optimalizovaném systému byly analyzovány vzorky rostlinných olejů, živočišných tuků a randomizačních směsí, pro které bylo následně popsáno retenční chování příslušných triacylglycerolů včetně jejich regioizomerů. Dále bylo popsáno retenční chování cis-/trans- izomerů a triacylglycerolů obsahujících neobvyklé mastné kyseliny. Pomocí off-line dvourozměrné chromatografie byly studovány možnosti separace komplexních přírodních směsí triacylglycerolů. Sběr frakcí byl realizován v nevodném systému s obrácenými fázemi a jejich následná separace byla provedena v systému argentační chromatografie. Ortogonalita obou separačních systémů byla testována pro přírodní vzorky triacylglycerolů a jejich regioizomerů, které obsahovaly mastné kyseliny s rozdílnou délkou acylového řetězce, počtem, polohou a geometrií dvojných vazeb a různou regiozomerickou polohou mastných kyselin na skeletu glycerolu. Off-line dvourozměrná chromatografie obou komplementárních módů přinesla lepší chromatografickou selektivitu, která vedla k vyššímu počtu identifikovaných triacylglycerolů. Optimalizace podmínek randomizační reakce umožnila připravit ze zvolených standardů jednoduchých triacylglycerolů příslušné regioizomery. Randomizační reakci bylo možné použít pro jakýkoli počet a druh jednoduchých standardů triacylglycerolů. Tato reakce byla ověřena na reálných vzorcích rostlinných olejů a dále byla používána k přípravě různých syntetických směsí regioizomerů. Jednotlivé triacylglyceroly, které byly separovány při analýzách, byly identifikovány hmotnostním spektrometrem s chemickou ionizací za atmosférického tlaku (APCI-MS). Pro identifikované triacylglyceroly byly popsány významné fragmentové ionty pozorované v APCI hmotnostních spektrech a byla určena převládající mastná kyselina v poloze sn-2. Pomocí popsaných fragmentových iontů bylo uskutečněno srovnání pěti různých hmotnostních spektrometrů. Bylo zjištěno, že vliv odlišných typů hmotnostních analyzátorů byl nižší ve srovnání s efektem počtu dvojných vazeb, jejich polohy na acylovém řetězci a regiospecifické distribuci acylových řetězců na skeletu glycerolu.

Abstract:

This dissertation thesis deals with the analysis of complex triacylglycerol mixtures. Triacylglycerols constitute an important part of our food, these mixtures play a significant role in many biological processes in the human body. This work summarizes the results obtained in the separation and subsequent identification of triacylglycerols and their regioisomers contained in vegetable oils, animal fats and randomization mixtures. Results were presented in four publications in international scientific journals. Triacylglycerols may differ in many parameters. In nature, triacylglycerol combinations form very complex mixtures, which cannot be identified without their previous separation. To obtain maximum number of separated triacylglycerols, chromatographic conditions were optimized in the silver-ion chromatographic system. The mobile phase composition and the length of the column were found to have a significant influence on the efficiency of triacylglycerols separation, especially of their regioisomers. The retention behavior of triacylglycerols and their regioisomers in vegetable oils, animal fats and randomization mixtures were described. Further, the retention behavior of cis-/trans- isomers and triacylglycerols containing unusual fatty acids was described as well. The separation of complex mixtures of natural triacylglycerols were studied using off-line two-dimensional chromatography. The fraction collection was carried out in non-aqueous reversed-phase system and their subsequent separation was carried out in the silver-ion system. The orthogonality of both separation systems was tested for natural samples of triacylglycerols and their regioisomers, which contained fatty acids with different acyl chain lengths, number, position and geometry of double bonds and different regiosomeric position of fatty acids on the glycerol skeleton. Off-line twodimensional chromatography of both complementary modes yielded better chromatographic selectivity, which led to a higher number of identified triacylglycerols. The optimization of the randomization reaction conditions enabled to prepare the regioisomers from the chosen standards of simple triacylglycerols. The randomization reaction could be used for any number and type of simple triacylglycerol standards. This reaction was verified on real samples of vegetable oils and it was also used for prepare of individual synthetic mixtures of regioisomers. Individual triacylglycerols, which were separated in the analyses, were identified using mass spectrometer with atmospheric pressure chemical ionization (APCI-MS). For identified triacylglycerols significant fragment ions observed in APCI mass spectra of triacylglycerols were described and prevailing fatty acids in position sn-2 were determined. The comparison of five mass spectrometers was realized by using the described fragment ions. It was found that the effect of differences in mass spectrometers was lower in comparison with the effect of double bonds, their position on the acyl chains and regiospecifity distribution of acyl chains on glycerol skeleton.

Klíčová slova

triacylglyceroly, regioizomery, randomizace, rostlinné oleje, živočišné tuky, argentační chromatografie, hmotnostní spektrometrie, chemická ionizace za atmosférického tlaku

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 11. 2012

Zveřejnit od: 31. 12. 2999

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 26. 2. 2013

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Doktorský studijní program / obor:
Analytická chemie / Analytická chemie