Imobilizácia lignolytických enzýmov

Bc. Nikola Schlosserová

Master's thesis

Imobilizace ligninolytických enzymů

Abstract:

Ligninolytické systémy našly své využití v potravinářském průmyslu ale využívají se také k degradaci různých cizorodých sloučenin a barviv. Tato vlastnost z nich činí užitečný nástroj pro bioremediačné ůčely a proto se zájem o ligninolytické enzymy zvyšuje. Tato práce se zabývá přípravou imobilizovovaného enzymu lignin peroxidázy metodou CLEA z hub Piptoporus betulinus, Trametes gibbosa a jejich společné kokultivácie. Byly srovnávany aktivity volných i imobilizovaných enzymů z těchto hub měřené pomocí UV/VIS spektrometru a byly stanoveny optimální podmínky precipitace a imobilizace metodou CLEA. Optimální pH precipitace proteinů bylo pro Piptoporus betulinus pH 7,0 pro Trametes gibbosa pH 5,0 a pro kokultiváci pH 6,0. Nejlepší koncentraci glutaraldehydu byla pro Piptoporus betulinus a kokultiváci 50 mM a pro Trametes gibbosa 10 mM. Imobilizaci se podařilo u všech enzymů zvýšit aktivitu o více než 20 %. Po optimalizaci přípravy CLEA enzymů se testovaly parametry jako je optimální pH, stabilita, teplotní optimum a stabilita. Všechny enzymy měli své pH optimum v kyselém až mírně kyselém prostředí a teplotní optimum se pohybovalo v rozmezí od 30 ℃ do 40 ℃. Imobilizovaný CLEA enzym z kokultivace byl ze všech nejstabilnější. Pro ověření aplikačního potenciálu se volné a CLEA enzymy testovali na třech potravinářských barvivech kde byla zkoumána jejich biodegradační schopnost. ůbytek barviva byl měřen pomocí HPLC s DAD detektorem. Významnou roli v tomto experimentu hrála sorpce houbami, které si v barvivech vytvořili mycelia a barvivo částečně nasály a proto u volných enzymů došlo k většímu úbytku barviva jako při jejich CLEA enzymech. Nejlepší schopnost dekolorizácie vykazoval volný enzym z houby Trametes gibbosa, který po 14. dnech kultivace odbarvil barvivo o více než 90 %. Celkově enzymy nejlépe odbarvovaly barvivo azorubin, protože všechny volné enzymy odbarvily toto barvivo po 14. dnech o více než 80%. CLEA enzymům se nepodařilo degradovat barviva v takové míře, což by mohlo být způsobeno tím, že se enzymy v barvivech nekultivovali se svým substrátem (veratrylalkoholom). Mnoho výzkumů se zabývá metodami jako zvyšovat aktivitu a produkci ligninolytických enzymů a výsledky v práci naznačují, že kokultivací by bylo možné zvýšit Lip aktivitu a imobilizaci vytvořit enzym se zlepšenými vlastnostmi.

Abstract:

Ligninolytic systems found their application in the food industry, but they are also used for the degradation of several xenobiotic compounds and dyes. This characteristic is making them be a useful tools for bioremediation purposes, that is why the interest in ligninolytic enzymes is increasing. The main aim of practical part was preparation of immobilized enzyme lignin peroxidase by method CLEA from fungus Piptoporus betulinus, Trametes gibbosa and their cocultivation. Activities of free and immobilized enzymes from these fungus were compared and measured by UV/VIS spectrometer. Conditions of precipitation and immobilization were specified by method CLEA. pH optimum for proteins precipitation were for Piptoporus betulinus pH 7,0, for Trametes gibbosa pH 5,0 and for cocultivation pH 6,0. The best concentration of glutaraldehyd, as a crosslinking agent, was for Piptoporus betulinus and cocultivation 50mM and for Trametes gibbosa 10mM. By immobilization, the activity of all enzymes were successfully increased up by 20 %. After optimalization of CLEA enzymes preparation, other parameters such as pH optimum, stability and temperature optimum and stability were tested. All enzymes had their pH optimum in acidic to slightly acidic environment and temperature optimum was in range from 30 °C to 40 °C. Immobilized CLEA enzyme from cocultivation was the most stable for all the enzymes. Free and CLEA enzymes were tested on synthetic food dyes, while their biodegradable ability was examined. Decrease of dyes was measured on HPLC with DAD detector. The sorption of fungi play an important role in this experiment, because fungi created mycelium and partially sorbed the dye. From this point of view, higher decolorization of dye in free enzymes in comparison with CLEA was observed. The best ability of decolorization was shown by a free enzyme from a Trametes gibossa, which after 14days of cultivation decolored more than 90 % dye. In total, significant decolorization (more than 80 % during 14 days) was achieved for azorubin. Degradation of dyes by CLEA was not so effective, which could be possibly caused by cultivation of enzymes without their substrate (veratrylalcohol). Cocultivation technique is very promising method how to increase LiP activity and concurrently create enzyme with improved properties.

Abstract:

Lignolytické systémy našli svoje využitie v potravinárskom priemysle ale využívajú sa aj k degradácií rôznych xenobiotických zlúčenín a farbív. Táto vlastnosť z nich činí užitočný nástroj pre bioremediačné účely a preto sa záujem o lignolytické enzýmy veľmi zvyšuje. Táto práca sa zaoberá prípravou imobilizovovaného enzýmu lignin peroxidázy metódou CLEA z húb Piptoporus betulinus, Trametes gibbosa a ich spoločnej kokultivácie. Porovnávali sa aktivity voľných aj imobilizovaných enzýmov z týchto húb merané pomocou UV/VIS spektrometra a boli stanovené optimálne podmienky precipitácie a imobilizácie metódou CLEA. Optimálne pH precipitácie proteínov bolo pre Piptoporus betulinus pH 7,0 pre Trametes gibbosa pH 5,0 a pre kokultiváciu pH 6,0. Najlepšou koncentráciu glutaraldehydu ako zosieťujúceho činidla bola pre Piptoporus betulinus a kokultiváciu 50 mM a pre Trametes gibbosa 10 mM. Imobilizáciou sa podarilo u všetkých enzýmov zvýšiť aktivitu o vyše 20 %. Po optimalizácií prípravy CLEA enzýmov sa testovali ďalšie parametre ako je optimálne pH, stabilita, teplotné optimum a stabilita. Všetky enzýmy mali svoje pH optimum v kyslom až mierne kyslom prostredí a teplotné optimum sa pohybovalo v rozmedzí od 30 ℃ do 40 ℃. Imobilizovaný CLEA enzým z kokultivácie bol zo všetkých najstabilnejší. Pre overenie aplikačného potenciálu sa voľné a CLEA enzýmy testovali na troch potravinárskych farbivách kde bola skúmaná ich biodegradačná schopnosť. Úbytok farbiva bol meraný na HPLC s DAD detektorom. Významnú úlohu v tomto experimente hrala sorpcia hubami, ktoré si vo farbivách vytvorili mycéliá a farbivo čiastočne nasali a preto u voľných enzýmov došlo k väčšiemu úbytku farbiva ako pri ich CLEA enzýmoch. Najlepšiu schopnosť dekolorizácie vykazoval voľný enzým z huby Trametes gibbosa, ktorý po 14. dňoch kultivácie odfarbil farbivo o vyše 90 %. Celkovo enzýmy najlepšie odfarbovali farbivo azorubin pretože všetky voľné enzýmy odfarbili toto farbivo po 14. dňoch o vyše 80 %. Enzýmom CLEA sa nepodarilo degradovať farbivá v takej miere, čo by mohlo byť zapríčinené tým, že sa enzýmy vo farbivách nekultivovali so svojim substrátom (veratrylalkoholom). Mnoho výskumov sa zaoberá metódami ako zvyšovať aktivitu a produkciu lignolytických enzýmov a výsledky v práci naznačujú, že kokultiváciou by bolo možné zvýšiť LiP aktivitu a imobilizáciou vytvoriť enzým so zlepšenými vlastnosťami.

Keywords

ligninolytické enzymy, CLEA, imobilizace, degradace, syntetické barviva

Keywords

CLEA, immobilization, degradation, ligninolytic enzymes, synthetic dyes

Keywords

lignolytické enzýmy, CLEA, imobilizácia, degradácia, syntetické farbivá

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 4. 2019

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Stanislava Voběrková, Ph.D.

Mendel University in Brno

Faculty of AgriSciences

Master programme / field:
Chemistry and Food Technology / Food Quality and Safety