Identifikace a biotypizace fytopatogenů kulturních rostlin pomocí hmotnostní spektrometrie

Bc. Jana CHALUPOVÁ

Master's thesis

Identification and biotyping of phytopathogens of cultivated plants using mass spectrometry

Abstract:

Tato diplomová práce se zabývá fytopatogeny zemědělsky důležitých rostlin, zvláště pak identifikací obligátních biotrofních patogenů jako jsou peronospory (říše Chromista, řád Peronosporales) a padlí (říše Fungi, řád Erysiphales) pomocí hmotnostní spektrometrie. Teoretická část této práce se věnuje fytopatogenům, zejména pak zástupcům řádu Peronosporales (peronospory) a Erysiphales (padlí), jejich fylogenezi, biologii, morfologii, životnímu a infekčnímu cyklu. Dále je rozebírána současná diagnostika těchto mikroorganismů, výhody a nevýhody soudobých metod se zaměřením na hmotnostní spektrometrii mikroorganismů, její historii, vývoj a využití. Praktická část se věnuje vývoji alternativního přístupu diagnostiky, který je založen na MALDI TOF hmotnostní spektrometrii intaktních buněk nebo spor, vyžaduje pouze malé množství biologického materiálu a umožňuje tak rychlé a relativně snadné zpracování a analýzu dat. Většina experimentů, které se věnovaly optimalizačním postupům přípravy vzorku, byla prováděna s plísní salátovou, Bremia lactucae a padlí rajčat, Oidium neolycopersici. Optimalizace pro MALDI-TOF hmotnostní analýzu intaktních spor zahrnovala výběr vhodné matrice, optimálního složení rozpouštědla, množství vzorku a matrice nanášených na MALDI destičku a výběr techniky nanášení. Byly testovány běžně dostupné MALDI matrice a použity jak samostatně, tak i v kombinaci s definovanými hmotnostními poměry. Trifluoroctová (TFA), mravenčí a octová kyselina atd. byly použity k okyselení roztoku pro extrakci proteinů z povrchu konidií. TFA byla testována v koncentraci 0,1-2,5% (v/v). Byl sledován vliv organických aditiv přítomných v roztoku rozpouštědla matrice. Pomocí těchto postupů byla shledána jako optimální kombinace matric kyseliny ferulové a sinapové rozpuštěných v hmotnostním poměru 1:3 v roztoku acetonitrilu a 2,5% TFA (7:3, v/v). Nejvhodnější nanášení suspenze spor a matrice bylo technikou vysušené kapky s volným odpařením při laboratorní teplotě. Hustota suspenze spor byla stanovena na 2 5 x 109 spor/mL, množství nanášené suspenze a matrice na MALDI destičku bylo 1 ?L. Další experimenty se zaměřily na hodnocení vlivu doby působení roztoku matrice na intaktní spory a výběr vhodného typu MALDI destičky (nerez, na bázi polymeru). Bylo testováno i použití enzymů celulas s cílem narušit buněčnou stěnu a uvolnit tak co nejvíce proteinů z povrchu buněčných stěn spor. Byla zkonstruována databáze peptidových a proteinových profilů, která by měla sloužit pro biotypizaci nových isolátů. Nakonec byl započat vývoj metody k identifikaci fytopatogenů přímo z listu, která by v budoucnu mohla nalézt uplatnění v diagnostice.

Abstract:

This diploma thesis deals with phytopathogens which invade agriculturally important plants, namely with mass spectrometric identification of obligate biotrophic pathogens like downy mildews (kindom Chromista, order Peronosporales) or powdery mildews (kindom Fungi, order Erysiphales). The theoretical part of this thesis describes phytopathogens, especially members of the order Peronosporales (downy mildews) and the order Erysiphales (powdery mildews), their phylogeny, biology, morphology, life and infection cycle. Furthermore, the current diagnostics of these microorganisms is disscussed including both advantages and disadvantages of recent methods with a focus on history, development and application of mass spectrometric analysis of intact microorganisms. The experimental part is devoted to the development of an alternative diagnostic approach based on intact cell or spore MALDI-TOF mass spectrometry, which requires only very small amount of biological material and allows fast as well as relatively easy sample processing and data interpretation. Experimental approaches for the mass spectrometric analyses were optimized using Bremia lactucae, cause of lettuce downy mildew, and Oidium neolycopersici, cause of tomato powdery mildew. This involved choosing of a proper MALDI matrix compound, looking for the optimal solvent composition and evaluation of different sample preparation techniques. Commonly available MALDI matrices were tested. The matrices were applied individually or in combinations with defined weight ratios. Trifluoroacetic acid (TFA), formic acid, acetic acid etc. were used to provide acidic conditions for the protein extraction from the surface of conidia. TFA was tested in concentrations of 0.1-2.5 % (v/v). The acidic aqueous matrix solution was optionally modified by adding water-miscible organic solvents. The most significant peptide/protein profiles were obtained with ferulic acid and sinapic acid as matrices dissolved in a weight ratio of 1:3 in acetonitrile: 2.5% TFA (7:3, v/v). The most suitable procedure for spores and matrix deposition on the target was using the dried droplet technique followed by evaporation at room temperature. The density of spore suspension was set to 2 5 x 109 spores/mL, 1 ?L of sample and 1 ?L of matrix were found optimal for the deposition on MALDI target. Further experiments were focused on playing with different times and temperatures of sample exposure to the matrix solution, using different target materials (stainless steel, polymer based). To enhance signals in MALDI-TOF protein profiles, a pre-treatment of cell suspensions with cellulases was successfully introduced. A database of mass spectra representing an archive of protein profiles of the studied phytopathogens was constructed to serve for biotyping (i.e. characterization based on biochemical traits) of field isolates. Finally, the development of method for phytopathogens mass spectrometry identification directly from leaf for future application in diagnostics was started.

Keywords

Bremia lactucae, Oidium neolycopersici, fytopatogen, peronospora, padlí, optimalizace, identifikace, biotypizace, ISMS (hmotnostní spektrometrie intaktních spor)

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2011

Identifier: 110910

Thesis defence

• Supervisor: Prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry