Fenoloxidázová kaskáda u hmyzu

Bc. Pavel Dobeš, Ph.D.

Diplomová práce

Phenoloxidase system in insect

Anotace:

Metoda spektrofotometrického stanovení aktivity enzymu fenoloxidázy (PO) s použitím 3,4-dihydroxyfenylalaninu (DOPA) jako substrátu byla optimalizována pro detekci enzymatické aktivity v plazmatické frakci hemolymfy zavíječe voskového Galleria mellonella. Touto metodou lze stanovit okamžitou, spontánně aktivovanou a po chemické aktivaci profenoloxidázy (pPO) prostřednictvím metanolu i celkovou hladinu PO v hemolymfě. Největší vliv na vlastní stanovení mají teplota a délka inkubace, které výrazně ovlivňují hladinu aktivního enzymu. Celková neboli pPO aktivita je podobnými faktory ovlivňována podstatně méně. Potvrzena byla také aktivace fenoloxidázové kaskády v odpovědi na působení vybraných elicitorů – zymosanu A a lipopolysacharidu. Pomocí inhibitorů biosyntézy eikosanoidů (IBE) indomethacinu a phenidonu byl prokázán vliv eikosanoidů na fenoloxidázovou kaskádu. Pro měření PO a pPO aktivity byl použit modifikovaný protokol vytvořený na základě výsledků optimalizací. Po aplikaci indomethacinu byl u pokusných larev zjištěn pokles okamžité PO aktivity, celkové PO aktivity a oslabení schopnosti reagovat na stimulaci zymosanem. Negativní vliv phenidonu byl zaznamenán pouze při stanovení hladiny okamžité a spontánně aktivované PO. Narušení metabolismu eikosanoidů vedlo u indomethacinu i phenidonu ke zpomalení růstu larev, který byl závislý na koncentraci použitých inhibitorů.

Abstract:

The spectrophotometric determination of phenoloxidase (PO) activity using 3,4-dihydroxyphenylalanin (DOPA) as substrate was optimized for detection of enzymatic activity in hemolymph plasma fraction of greater wax moth Galleria mellonella. This method can be used for determination of immediate, spontaneously activated and also total level of PO in hemolymph. Total PO activity can be measured after chemical activation of inactive prophenoloxidase (pPO) by organic solvent methanol. Temperature and incubation time are the main factors affecting this PO assay, because both of them can influence the level of active enzyme. Total PO level otherwise pPO activity is affected by these factors to a significantly lesser extent. The activation of phenoloxidase system in response to the selected elicitors – zymosan A and lipopolysaccharide was also confirmed. Using eicosanoid biosynthesis inhibitors (EBI) indomethacin and phenidone, the influence of eicosanoids on phenoloxidase system was proved. The PO and pPO activity was measured according to the modified protocol based on optimalization results. After indomethacin application the decrease of immediate PO activity, total PO activity and weakened capability to react on zymosan stimulation was determined in treated larvae. Adverse effect of phenidone was proved only in immediate PO level and in spontaneously activated PO. Disruption of eicosanoid metabolism by indomethacin and phenidone led to the retardation of the larval growth that was manifested in dose-dependent manner.

Klíčová slova

Eikosanoidy, fenoloxidáza, Galleria mellonella, indomethacin, phenidone, profenoloxidáza, stanovení enzymové aktivity. Determination of enzymatic activity, eicosanoids, phenoloxidase, prophenoloxidase.

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 11. 6. 2009
• Vedoucí: doc. RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Obecná biologie