Akrozomální integrita hřebčích spermií

Bc. Kateřina Špačková

Master's thesis

Acrosomal integrity of the stallion sperm

Abstract:

Cílem práce je ověřit hypotézu, že integrita akrozomu rozmražených hřebčích spermií je vyšší po inkubaci v inkubátoru při 37 °C s 5 % CO2 a nižší při inkubaci ve vodní lázni o teplotě 37 °C. Ejakulát byl odebírán v Equinním reprodukčním centru v Pardubicích – Mněticích (ERC s.r.o.) od hřebců různých plemen. Po odstředění byly spermie naředěny laktózovým ředidlem (EDTA). Naředěný ejakulát byl kryokonzervován v 5ml hliníkových tubách. Tuby byly rozmraženy ve vodní lázni (37 °C, 30-60 sekund). Následovala inkubace vzorků (n = 42) ve vodní lázni (37 °C) nebo v termostatu (37 °C, 5 % CO2). Část vzorků byla naředěna ihned po rozmražení a část těsně před samotným zhodnocením. Pro inkubaci v termostatu byl použit TALP bez HEPES. Pro inkubaci ve vodní lázni bylo přidáno k TALP 10 mM HEPES. Zhodnocení vzorků bylo provedeno ve dvou časech (T0 a T30). Pokus byl zahájen až po pětiminutové inkubaci vzorků. Čas T0 odpovídá tedy času 5 minut po rozmražení vzorku a po 30 minutách inkubace následovalo hodnocení v čase T30. Bylo provedeno zhodnocení vlivu prostředí, doby inkubace a času naředění na integritu akrozomu, mitochondriální integritu a viabilitu spermií. Statistické vyhodnocení bylo provedeno na hladině významnosti P < 0,05. Bez ohledu na typ inkubačního prostředí nebo čas naředění vzorku, byla integrita akrozomální membrány, mitochondriální integrita i viabilita hřebčích rozmražených spermií průkazně vyšší v čase T0 než v čase T30 (P < 0,05). V čase T0 ani T30 nebyl obecně prokázán vliv času naředění vzorku na akrozomální integritu, mitochondriální integritu a viabilitu spermií, pouze se dvěma výjimkami, kdy integrita akrozomální membrány spermií byla statisticky významně nižší u naředěných vzorků v čase T0 a procento mitochondriální integrity bylo průkazně vyšší u naředěných vzorků v čase T30 (P < 0,05). U žádného z hodnocených parametrů nebyl zjištěn statisticky významný vliv inkubačního prostředí v čase T0 ani T30 (P > 0,05). V čase T0 ani T30 se neprojevil vliv času naředění vzorku, a to u vzorků inkubovaných ve vodní lázni ani v termostatu (P > 0,05). Pouze v prostředí termostatu bylo v čase T0 procento spermií s intaktní akrozomální membránou vyšší u vzorků nenaředěných a v čase T30 bylo procento mitochondriální integrity spermií významně vyšší u vzorků naředěných (P < 0,05). U žádného z parametrů nebyl v čase T0 ani v čase T30 zjištěn statisticky významný rozdíl mezi inkubačním prostředím, a to jak u vzorků naředěných, tak nenaředěných (P > 0,05).

Abstract:

The aim of this thesis is to verify the hypothesis that the integrity of acrosome of frozen- thawed stallions sperm is higher after incubation in the incubator at 37 °C with 5% CO2 and lower when incubated in a water bath (37 °C). Ejaculate was collected at Equine Reproduction Center in Pardubice - Mnětice (ERC s.r.o.) from stallions of different breeds. Ejaculate was centrifugated and diluted with lactose diluent (EDTA). Then was cryopreserved in 5 ml aluminum tubes. The tubes were thawed in a water bath (37 ° C, 30-60 s). Samples (n = 42) were incubated in a water bath (37 ° C) or thermostat (37 ° C, 5 % CO2). One part of samples was diluted immediately after thawing and second part just prior to evaluation. For incubation in the thermostat TALP without HEPES was used, for water bath, 10 mM HEPES was added. Sample evaluation was performed at two times (T0, T30). The experiment was initiated after five minutes of incubation. Thus, time T0 corresponds to the time 5 minutes after the thawing. The effect of atmosphere, incubation time and dilution time on acrosome integrity, mitochondrial integrity and sperm viability were assesed. Statistical evaluation was performed at a significance level of P <0.05. Regardless of the type of incubation medium or sample dilution time, the integrity of the acrosomal membrane, the mitochondrial integrity and the viability of sperm were significantly higher at time T0 than at time T30 (P <0.05). At time T0 and T30, the effect of sample dilution time on acrosomal integrity, mitochondrial integrity and sperm viability was not generally proven, but there were two exceptions where the integrity of the acrosomal membrane of the sperm was statistically significantly lower in the diluted samples at time T0 and the percentage of mitochondrial integrity was significantly higher of diluted samples at time T30 (P > 0.05). No statistically significant influence of the incubation conditions at time T0 and T30 was found for any of the evaluated parameters (P > 0.05). At time T0 and either T30, the effect of sample dilution time had no influence to samples incubated in the water bath or in the thermostat (P > 0.05). Only in the thermostat in T0 was higher percent of sperm with the intact acrosome membrane in undiluted samples, and at T30 the percent of mitochondrial sperm integrity was significantly higher in diluted samples (P <0.05). No statistically significant difference between the incubation conditions, both in the diluted and the non-diluted samples, was observed at either time T0 or T30 (P> 0.05)

Keywords

reprodukce, hřebec, spermie, akrozomální reakce

Keywords

stallion, sperm, acrosomal reaction, reproduction

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Jiří Šichtař, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Genetic Technologies and Breeding / Biotechnology of Reproduction