Enzymy zapojené do metabolismu cytokininů v kukuřici

Mgr. Radka KONČITÍKOVÁ

Doctoral thesis

Study of plant aldehyddehydrogenases in connection to cytokinin metabolism

Abstract:

The presented Ph.D. thesis is focused on characterization of enzymes, which could be linked to degradation pathway of cytokinins in maize. Cytokinins are plant hormones, which play an important role in many developmental processes like regulation of cell proliferation and differentiation in root and shoot apical meristems, differentiation of plastids etc. Cytokinins negatively control root elongation and branching and the main naturally occurring cytokinins are N6-prenylated adenine/adenosine derivatives, such as N6-(2-isopentenyl)adenine (iP) and zeatin (Z) and their ribosides iPR and ZR. Cytokinin oxidase/dehydrogenase (CKO/CKX, EC 1.5.99.12) catalyzes irreversible degradation of above cytokinins to the corresponding adenine or adenosine and aldehyde. The first aim of the work was to better understand substrate specificity differences among CKO isoforms and to search for more complex inhibitors. In consequence, new structures of CKO2 and CKO4a from maize as well as the binding mode of cytokinin ribosides were analyzed. New thidiazuron-derived inhibitors were tested and their binding was analyzed by X-ray crystallography. The importance of CKO glycosylation for the enzyme stability was studied using CKO1 from maize. The second aim of this work was to search for enzymes involved in possible interconversion of CKO reaction products. The search was focused on a superfamily of aldehyde dehydrogenases (ALDHs), which could metabolize the released aldehyde, and also on a family of nucleoside-N-ribohydrolases (NRH, EC 3.2.2.1), which could catalyze the interconversion of adenosine to adenine as well as the interconversion of cytokinin ribosides to bases. Aldehydes are toxic, cancerogenic and mutagenic at higher concentrations and ALDHs are responsible for oxidation of biogenic aldehydes as well as for cell detoxification of aldehydes generated during lipid peroxidation. So far, 13 ALDH families have been described in plants. To get insight into their function, 10 maize genes covering three ALDH families (family 2, 7 and 10) were analyzed. Crystal structures of representatives of these three families were solved and their kinetics was characterized. It was found that ALDH2 family isoforms are able to oxidize aldehydes released from CKO reaction. NRHs catalyze a hydrolysis of nucleosides to nucleobase and ribose and the study was focused on purine nucleoside N-ribohydrolase, namely NRH3 from maize (ZmNRH3). Kinetic and structural study was performed and it was found that both adenosine and iPR/ZR can be metabolized to corresponding bases adenine and iP/Z.

Abstract:

Předkládaná disertační práce je zaměřena na charakterizaci enzymů, které by mohly být spojeny s degradací cytokininů v kukuřici. Cytokininy jsou rostlinné hormony, které hrají důležitou roli v mnoha vývojových procesech, jako je regulace buněčného dělení a vývoje kořene a prýtu, diferenciace plastidů atd. Cytokininy často kooperují s dalšími rostlinými hormony, zejména auxiny. Přirozeně se vyskytující cytokininy jsou N6-prenylované deriváty adeninu / adenosinu, jako N6- (2-isopentenyl) adeninu (iP) a zeatin (Z) a jejich ribosidy iPR a ZR. Cytokininoxidasa / dehydrogenasa (CKO / CKX, EC 1.5.99.12) katalyzuje ireverzibilní degradaci cytokininů na adeninu nebo adenosinu a odpovídající aldehyd. Prvním cílem práce bylo lépe popsat rozdíly v substrátové specificitě mezi jednotlivými isoformami CKO a najít účinnější inhibitory. V důsledku toho, byly analyzovány nové struktury CKO2 a CKO4a z kukuřice, stejně jako vazebný způsob cytokininových ribosidů. Byly testovány nové inhibitory odvozené od thidiazuronu a pomocí rentgenové krystalografie analyzována jejich vazba. Vliv glykosylace na stabilitu enzymu byl studován na CKO1 z kukuřice. Druhým cílem této práce bylo hledání enzymů podílejících se na možné interkonverzi reakčních produktů metabolismu cytokininů. Hledání bylo zaměřeno na nadrodinu aldehyddehydrogenas (ALDHs), které by mohly metabolizovat uvolněný aldehyd, a také na rodiny nukleosid-N-ribohydrolas (NRH, EC 3.2.2.1), které mohou katalyzovat vzájemnou přeměnu adenosinu na adenin, stejně jako interkonverzi cytokininových ribosidů na odpovídající báze. Aldehydy jsou při vyšších koncentracích toxické, kancerogenní a mutagenní. ALDHs jsou zodpovědné za oxidaci biogenních aldehydů, podobně i za detoxifikaci aldehydů vznikajících při peroxidaci lipidů. Dosud bylo popsáno 13 ALDH rodin v rostlinách. Pro bližší pochopení jejich funkcí, bylo analyzováno 10 kukuřičný genů ze tří ALDH rodin (rodina 2, 7 a 10). Byly řešeny krystalové struktury zástupců těchto tří rodin, a také charakterizovány jejich kinetické vlastnosti. Bylo zjištěno, že izoenzymy z ALDH2 rodiny jsou schopny oxidovat aldehydy produkované CKO. NRHs katalyzují hydrolýzu nukleosidů na odpovídající báze a ribózu. Byly studovány purinové nukleosid N-ribohydrolasy, a to NRH3 z kukuřice (ZmNRH3). Na základě provedených kinetických a strukturální studií bylo zjištěno, že jak adenosin tak i iPR / ZR mohou být metabolizovány na odpovídající báze adenin a iP / Z.

Keywords

Cytokinin, Cytokininoxidasa / dehydrogenas, aldehyddehydrogenasa, nukleosid-N-ribohydrolasa

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 9. 2015

Accessible from:: 3. 9. 2015

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. David Kopečný, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry