Human shelterin assembly and transcription regulation

Ing. Tomáš Janovič, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Telomery tvoří ochrannou část konců lineárních chromozomů. Regulace délky telomer je nezbytná pro zajištění stability genomu. Narušení udržování telomer vede k jejich nefunkčnosti, což má za následek zkracování telomer spojené s nemocemi, jako je syndrom selhání kostní dřeně, předčasné stárnutí a rakovina. Udržování telomer je závislé na přísné koordinaci mezi telomerovými proteinovými komplexy, telomerázou a telomerovou DNA. Shelterin představuje hlavní proteinový komplex, který váže telomerovou DNA s vysokou afinitou a sekvenční specifitou. Shelterin rovněž rekrutuje řadu telomerových faktorů, včetně telomerázy, a je zodpovědný za utváření telomerové struktury a ochranu telomer před opravami při poškození DNA. Seskupení a vzájemná koordinace lidských proteinů shelterinu může regulovat funkce celého komplexu. Tvorba komplexu prostřednictvím dynamických interakcí mezi podjednotkami shelterinu je proto pro udržování telomer zcela klíčová. Abychom objasnili molekulární mechanismus formace lidského shelterinu, zaměřili jsme se na faktory TRF1 a TRF2 (telomeric repeat binding factor 1 a 2), které spolu s TIN2 (TERF1-interacting nuclear factor 2) proteinem tvoří jádro shelterinového komplexu. Aplikovali jsme "single-molecule" přístup založený na fluorescenční kros-korelační spektroskopii (FCCS) ke sledování spontánních fluktuací intenzity při difúzi různě fluorescenčně značených TRF1/TRF2 a TIN2 proteinů konfokálním objemem mikroskopu. Kros-korelační analýza naměřených signálů intenzit nám umožnila objasnit tvorbu komplexu TRF1-TIN2-TRF2. Zjistili jsme, že TRF1 faktor může efektivně nahradit faktor TRF2 navázaný na TIN2 podjednotku. Naproti tomu faktor TRF2 neměl na komplex TRF1-TIN2 žádný zřetelný vliv. Dále jsme hodnotili vliv shelterinového faktoru TPP1 (adrenocortical dysplasia protein homolog) na podporu komplexace celého shelterinu. K našemu očekávání, přídavek proteinu TPP1 rozšířil vazebnou kapacitu podjednotky TIN2 a umožnil, aby navázal současně faktory TRF1 i TRF2. Navrhli jsme model popisující kompletaci klíčových podjednotek lidského shelterinu v roztoku. Vyzdvihli jsme vazbu proteinu TPP1 na TIN2 podjednotku jako esenciální krok při formování stabilního shelterinu. Následně jsme navrhli interakci TPP1-TIN2 jako potenciálně nejslabší místo při vytváření shelterinu a tedy i při udržování telomer. Výsledky práce přispívají k objasnění mechanismu sestavování lidského shelterinu a popisují úlohu proteinu TPP1 při zprostředkování komplexace shelterinu. Získané poznatky se zabývají kooperací telomerových proteinů o plné délce, které jsou nezbytné pro udržování telomer, na "single-molecule" úrovni. Mimoto posloužila "single-molecule" platforma založená na FCCS k metodicky příbuzným studiím, kde jsme charakterizovali praktické dopady deuterované vody v metodách založených na fluorescenci.

Abstract:

Telomeres provide the protective cap to the ends of linear chromosomes. The regulation of telomere length is essential in maintaining genome stability. Impairing the telomere maintenance leads to dysfunctional telomeres, resulting in telomere shortening associated with diseases such as bone marrow failure, premature aging, and cancer. Telomere maintenance is dependent on strict coordination between telomeric protein complexes, telomerase, and telomeric DNA. Shelterin represents the major protein complex that binds telomeric DNA with a high affinity and sequence specificity. Moreover, shelterin directly recruits numerous telomere-associated factors, including telomerase, and is responsible for shaping the telomeric structure and guarding telomeres against DNA damage response machinery. The assembly and cooperation of human shelterin proteins can regulate the functions of the whole complex. Therefore, the complex formation through dynamic interactions between shelterin subunits is essential in telomere maintenance. To elucidate the molecular mechanism of human shelterin assembly, we focused on the telomeric repeat binding factors TRF1 and TRF2, which together with TIN2 (TERF1-interacting nuclear factor 2) form the core of the shelterin complex. We applied a single-molecule approach based on fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) to monitor the spontaneous intensity fluctuations as the differently fluorescently labeled TRF1/TRF2 and TIN2 diffuse through the confocal volume of a microscope. The cross-correlation analysis of measured intensity traces enabled us to understand the TRF1-TIN2-TRF2 complex formation. We found that TRF1 can effectively replace TRF2 bound to TIN2. In contrast, TRF2 had no evident effect on the TRF1-TIN2 complex. Furthermore, we assessed the effect of shelterin factor TPP1 (adrenocortical dysplasia protein homolog) in promoting whole shelterin complexation. Strikingly, TPP1 addition expanded the TIN2 binding capacity and allowed TIN2 to accommodate both TRF1 and TRF2 simultaneously. We proposed a model describing the assembly of human shelterin core subunits in solution. We highlighted the TPP1 binding to TIN2 as an essential step in stable shelterin formation. Moreover, we suggested the TPP1-TIN2 interaction as the potential weakest point in shelterin assembly, hence the critical step in telomere maintenance. The thesis outcomes contribute to understanding human shelterin assembly and describe the role of TPP1 in promoting the whole shelterin complexation. The obtained findings address the cooperation of full-length telomeric proteins essential in telomere maintenance at the single-molecule level. In addition, the FCCS-based single-molecule platform served for methodologically related studies, where we characterized the practical impacts of deuterated water in fluorescence-based methods.

Keywords

shelterin, telomere, microscopy, single-molecule, fluorescence correlation spectroscopy, telomera, mikroskopie, fluorescenční korelační spektroskopie

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 3. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 4. 5. 2022
• Supervisor: doc. Mgr. Ctirad Hofr, Ph.D.
• Reader: Mgr. Veronika Altmannová, Ph.D., doc. RNDr. Petr Pečinka, CSc., Jens Schmidt, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Life Sciences / Life Sciences