Strategie pro reprodukovatelnou analýzu malých molekul v lidských krevních vzorcích pomocí plynové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií

Akrem Jbebli, Ph.D.

Disertační práce

Strategies for reproducible small molecule gas chromatography - mass spectrometry analysis of human blood samples

Anotace:

Analýza malých molekul v lidských biosamplách je zásadní pro pochopení fyziologie a vzájemného působení endogenního metabolismu a environmentálních expozic. Plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií (GC–MS) je dobře zavedená platforma pro profilování metabolitů, avšak její využití v molekulární epidemiologii bylo omezeno nízkou propustností a vysokou spotřebou vzorků, spolu s neúplnou dokumentací metod a nekonzistentním řízením kvality a reportováním, což brání reprodukovatelnosti a smysluplné biologické interpretaci. Kritická revize analýzy malých molekul pomocí hmotnostní spektrometrie pro výzkum exposomu člověka zdůraznila, jak pokroky v metabolomice formovaly současné pracovní postupy, a identifikovala klíčové mezery v přípravě vzorků, automatizaci, zpracování dat a transparentnosti metod. Pro řešení těchto omezení, zejména chyb při manuální manipulaci, nekonzistentního načasování a nedostatečné sledovatelnosti kroků přípravy vzorků, byla vyvinuta a optimalizována automatizovaná dvoustupňová metoda GC–Orbitrap MS s methoximací/silylací pro malé objemy (3 µL) lidské krve. Manuální manipulace se vzorky byla minimalizována přímou extrakcí-derivací ze sušené krve (plazma, sérum, celé sušené kapky krve). Metoda dosáhla dobré opakovatelnosti a širokého pokrytí metabolitů s rychlejší operací mezi vzorky a vyšší transparentností reportování než srovnatelné alternativy. Protokol a všechny doprovodné zdroje byly veřejně zpřístupněny pro podporu replikace a adopce metody. Vyvinutá automatizovaná metoda přípravy vzorků byla následně přizpůsobena pro aplikaci na krev odebranou pomocí zařízení pro volumetrické absorpční mikrosamplování (Mitra®). Pilotní studie porovnala GC-MS profily metabolitů získané z tradičních sušených kapek krve s Mitra, pro kapilární i venózní krev, a prokázala systematické rozdíly související se zařízením v intenzitě signálu a profilech znaků. Práce demonstruje zvýšenou propustnost profilování metabolitů u terénně nasaditelných formátů mikrosamplování krve a osvědčené postupy reportování metod. Dohromady to poskytuje proveditelnost pro replikaci na více pracovištích a aplikace v populačním měřítku.

Abstract:

Analysis of small molecules in human biosamples is essential for understanding physiology and the interplay between endogenous metabolism and environmental exposures. Gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS) is a well-established platform for metabolite profiling, but research applications in molecular epidemiology have been limited by modest throughput and large sample volume consumption, alongside incomplete documentation of methods and inconsistent quality management and reporting that hinders reproducibility and meaningful biological interpretation. A critical review of small-molecule mass spectrometry analysis for human exposome research highlighted how advances in metabolomics have shaped current workflows and pinpointed key gaps in sample preparation, automation, data processing and method transparency. To address these limitations, particularly manual handling errors, inconsistent timing and poor traceability of sample-preparation steps, an automated two-step methoximation/silylation GC–Orbitrap MS method was developed and optimised for small volumes (3 µL) of human blood. Manual sample handling was minimised through the direct extraction-derivatisation of blood-based samples (plasma, serum, whole dried blood spots). The method achieved good repeatability and broad metabolite coverage with faster sample-to-sample operation and greater reporting transparency than comparable alternatives. The protocol and all accompanying resources are publicly released to support replication and method adoption. The developed automated sample preparation method was then translated for application to blood collected via a volumetric absorptive microsampling device (Mitra®). A proof-of-concept study compared GC-MS based metabolite profiles acquired from traditional dried blood spots to Mitra, for capillary and venous blood, and demonstrated systematic device-related differences in signal intensity and feature profiles. The work demonstrates increased throughput metabolite profiling of field-deployable blood microsampling formats and best practice reporting of procedures. Combined, this provides feasibility for multi-site replication and population scale applications.

Keywords

Mass spectrometry, gas chromatography, quality control, quality assurance, quality management, automation, derivatisation, oximation, silylation, microsampling, reliability, reproducibility

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 1. 2026

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 13. 2. 2026
• Vedoucí: PhD Elliott James Price
• Oponent: Maria I. Klapa, PhD, Prof. Dr. Stefan Christian Gaugler, Prof. Dr. Karsten Hiller

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Životní prostředí a zdraví / Environmentální chemie a toxikologie