Regulation of WNT signaling components by kinases: unconventional aspects

Mgr. Igor Červenka, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

WNT signalizace zahrnuje několik evolučně konzervovaných signálních drah, které se významně podílí na regulaci embryonálního vývoje, buněčné proliferaci, migraci a polarizaci. Během posledních dvaceti let jsme se stali svědky nárůstu objevených regulačních proteinů ovlivňujících tyto dráhy. V současnosti se pozornost přesouvá směrem k posttranslačním modifikacím a jejich vlivu na výstupy signalizace. Fosforylace jsou schopny upravovat a jemně ladit nejrůznější buněčné procesy. Hlavním cílem této práce bylo identifikovat nové způsoby regulace WNT signální dráhy, které jsou zpostředkovány kinázami, a popsat jejich účinek na propagaci signálu. Pro transdukci signálu v kanonické větvi WNT signalizace je nepostradatelný transmembránový ko-receptor LRP6, hlavně jeho intracelulární část. Vědci identifikovali několik kináz zodpovědných za fosforylaci této domény, zatím ale nedošlo k vytvoření sjednocující hypotézy popisující jejich působení. V naší studii jsme se snažili potvrdit, že v tomto procesu se uplatňují i další kinázy. Identifikovali jsme skupinu mitogeny aktivovaných kináz jako potenciální regulátory WNT signalizace. Zároveň jsme dokázali, že intracelulární doména lrp6 slouží jako místo, kde dochází za pomoci fosforylací k interakcím různých signálních drah. V posledních letech se objevuje čím dál více zpráv o působení komponent WNT signalizace v centrozomu. Fosfoprotein Dishevelled slouží jako lešení pro meziproteinové interakce a je centrem několika signálních kaskád. Jeho jedinečnou schopností je usměrňovat tok signálů do různých větví. Ukázali jsme, že Dishevelled je kromě role v resorpci cilií také nepostradatelný pro zdárný průběh buněčného cyklu a maturaci centrozomů. Dishevelled je fosforylovaný kinázou NEK2 a tyto modifikace zvyšují jeho afinitu k proteinům centrozomálního linkeru. Nadměrná exprese Dishevelled nutí proteiny CDK5RAP2 a C-NAP1 oddělit se od centrozomálního linkeru. V buňkách s oslabenými kontrolními body, jako například v bunečné linii HEK293, způsobuje jeho nadměrná exprese formování monopolárního dělícího vřeténka. Dishvelled zde slouží jako lešení, které poskytuje rozhraní pro efektivní vazbu proteinů centrozomálního linkeru s kinázou NEK2. Narušení tohoto lešení může mít za následek jak zástavu buněčného cyklu, tak i nestabilitu chromozomů. Podařilo se nám také potvrdit další role tohoto jedinečného proteinu, které spočívají v posttranslačních modifikacích.

Abstract:

WNT signaling pathways are a conserved mechanism for regulation of embryonic development, homeostasis, migration and polarity. During the last twenty years, we witnessed the emergence of new protein regulators and key players. Presently, focus is being diverted to elucidating how posttranslational modifications can influence the outcome of the pathway. Phosphorylations adjust and fine tune cellular processes. Main aim of this study was to identify novel regulation of WNT signaling components by previously undescribed kinases and their influence on signaling outcome. LRP6 is a transmembrane co-receptor for canonical WNT pathway, whose intracellular domain is indispensable for signal transduction. Several kinases have been implicated in phosphorylation of this domain, but scientists have not been able to formulate single consensual hypothesis about their action. We tried to explore whether the pool of kinases is more extensive and identified members of mitogen-activated kinase family as potential regulators of WNT signaling. This proved that the intracellular portion of lrp6 serves as a cross-talk domain that can integrate signals from other activated pathways by means of phosphorylations. Over the last years, evidence of WNT signaling components in centrosome has been slowly accumulating. Phosphoprotein Dishevelled is a scaffolding element, that serves as a hub and anchor for many signaling components in WNT signaling pathways and has a unique ability to direct signaling events into distinct branches. We have shown that Dishevelled, apart from its role as regulator of cilia disassembly, plays important role during cell cycle progression and centrosome maturation. It is phosphorylated by NEK2 kinase and such modification enhances its ability to interact with proteins of centrosomal linker CDK5RAP2 and C-NAP1. Overexpression of Dishevelled forces depletion of linker proteins from centrosome. In the cells with compromised checkpoints like HEK293, overexpression of Dishevelled causes extensive formation of monopolar spindles. Dishevelled scaffold provides interfaces for efficient interaction of linker proteins with NEK2 kinase and deregulation of such scaffold can cause both cell cycle arrest and chromosomal instabilities. We were able to unveil additional roles for this unique protein which relies on posttranslational modifications.

Keywords

WNT signaling pathways, centrosome, kinases, phosphorylation, Dishevelled, NEK2, WNT signální dráhy, centrozóm, kinázy, fosforylace

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 11. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 28. 11. 2014
• Supervisor: doc. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.
• Reader: Mgr. Lukáš Čajánek, Ph.D., prof. Andrew Fry

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology