Mutageneze a izolace rekombinantního proteinu I63F

Mgr. Bc. Tomáš Starý

Bachelor's thesis

Mutagenisation and isolation of recombinant protein I63F

Abstract:

Kryptogein je bazický 10kD elicitin produkovaný fytopatogenní oomycetou Phytophthora cryptogea. Elicity patří mezi transferové proteiny se schopností vázat mastné kyseliny a steroly do hydrofobní kavity. Po navázání lipidu dochází ke změně jejich konformace, která umožňuje následnou interakci s rostlinným receptorem na povrchu buněk a vyvolání odpovědi u rostlin, zahrnující například produkci aktivních kyslíkových forem nebo změny v iontových tocích, vedoucí až k nekróze pletiv. Byly navrženy mutantní formy kryptogeinu u kterých se předpokládá omezená schopnost vázat steroly a mastné kyseliny do kavity a tudíž omezená schopnost elicitovat obrannou reakci. Cílem bakalářské práce byla mutageneze genu X24 kódujícího divokou formu kryptogeinu nahrazením sekvence pro izoleucin v poloze 63 za fenylalanin metodou PCR a produkce mutatního proteinu I63F v expresním systému Pichia pastoris. Výsledkem celého postupu bylo osm variant kryptogeinu I63F produkovaného vybranými klony Pichia pastoris s rekombinantně začleněnou mutantní formou genu X24.

Abstract:

Cryptogein is a basic 10kD elicitin secreted by phyto-pathogen oomycete Phytophthora cryptogea. Elicitins belongs to lipid transfer proteins family with ability to bind fatty acids and sterols to it´s hydrophobic cavity. Lipid binding affects the structure of cryptogein enabling consequent interaction with its binding site on plant plasma membrane triggering defence reactions, such as the production of active oxygen species or changes ion fluxes, leading to tissue necrosis. The mutant forms of cryptogein with expect limited ability to bind fatty acids and sterols, and elicit defence reaction were design. The goal of the thesis was mutagenesis of gene X24 encoding wild type of cryptogein via replacing sequence for isoleucine 63 for phenylalanine using PCR method. The consequent production of cryptogein mutant I63F in Pichia pastoris expression system was done. The result of all procedure was eight variants of I63F cryptogein produced by selected clones Pichia pastoris with recombinant integration of mutant form of gene X24.

Keywords

Phytophthora cryptogea, elicitiny, kryptogein, hydrofobní kavita, gen X24, I63F, pPIC9, Pichia pastoris

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 16. 6. 2009
• Supervisor: doc. Mgr. Tomáš Kašparovský, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry