Detekce onkogenních mutací u karcinomu děložního hrdla pomocí metody “High Resolution Melting” (HRM)

Bc. et Bc. Klára Rozehnalová

Master's thesis

Detection of oncogenic mutations in cervical carcinoma using method “High Resolution Melting” (HRM)

Abstract:

Karcinom děložního hrdla je celosvětově třetím nejrozšířenějším nádorovým onemocněním u žen. Hlavním rizikovým faktorem rozvoje cervikálního karcinomu je infekce vysoce rizikovými lidskými papilomaviry. Na vzniku karcinomu mají ovšem podíl i další faktory, mezi které patří i četné genetické změny, jako jsou chromozomové aberace, epigenetické modifikace či genové mutace. Cílem této diplomové práce bylo provést mutační screening u vzorků karcinomu děložního hrdla získaných od 24 pacientek Oddělení gynekologické onkologie Masarykova onkologického ústavu Brno. Jako screeningová metoda byla využita analýza křivek tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melting, HRM), pro potvrzení a identifikaci sekvenčních změn bylo zvoleno Sangerovo sekvenování. Celkem bylo analyzováno 13 mutačních "horkých míst" 12 genů (BRCA2, CTNNB1, EP300, ERBB2, FBXW7, HRAS, KRAS, MAPK1, NFE2L2, PTEN, STK11, a promotoru genu TERT). Pomocí HRM analýzy bylo detekováno 11 sekvenčních změn u 10 pacientek (v genech CTNNB1, FBXW7, PTEN a v promotoru genu TERT). U tří pacientek byly sekvenční změny Sangerovým sekvenováním potvrzeny a identifikovány, a to u jedné pacientky v genu FBXW7 a dvou pacientek v genu PTEN. Výsledky mutačního screeningu byly posléze spojeny s pilotní studií Wayhelové et al. (2016), kteří u týchž vzorků analyzovali přítomnost mutací v mutačních "horkých místech" genů EGFR, KRAS, PIK3CA a TP53. V obou mutačních analýzách bylo celkově metodou HRM zachyceno 21 sekvenčních změn v šesti genech (CTNNB1, FBXW7, KRAS, PIK3CA, PTEN a v promotoru genu TERT) u 16 pacientek. Sangerovým sekvenováním se dohromady podařilo identifikovat sedm sekvenčních změn, a to u dvou pacientek v genu PIK3CA (mutace M1043I a N1044D u jedné pacientky a E542K a D549N u druhé pacientky), jedné pacientky v genu FBXW7 (mutace R505G) a dvou pacientek v genu PTEN (mutace E157fs a Y138D, každá u jedné pacientky). Výsledky mutačních analýz byly následně zhodnoceny v souvislosti s klinickými a molekulárně-cytogenetickými daty daných pacientek. Byla pozorována asociace výskytu sekvenčních změn v genu KRAS u adenokarcinomů a HPV negativních karcinomů, dále spojitost sekvenční změny v genu KRAS s horší prognózou a zvýšenou pravděpodobností recidivy onemocnění. Také byl prokázán výskyt sekvenčních změn v promotoru genu TERT u pacientek bez přítomnosti amplifikace genu hTERC. Získané výsledky potvrdily roli genových mutací při vzniku karcinomu děložního hrdla a jejich možné využití jako prognostických faktorů.

Abstract:

Cervical cancer is the third most frequent cancer among women worldwide. The major risk factor for the development of cervical carcinoma is infection with high-risk human papillomaviruses. However, there are also some other factors contributing to the etiology of carcinoma, including numerous genetic changes such as chromosomal aberrations, epigenetic modifications or gene mutations. The aim of this diploma thesis was to perform mutational screening in cervical carcinoma samples obtained from 24 patients of Department of Gynecologic Oncology in the Masaryk Memorial Cancer Institute in Brno. High Resolution Melting analysis was used as a screening method and positive findings were futher confirmed and identified by Sanger sequencing. In total, 13 mutational hot spots of 12 genes (BRCA2, CTNNB1, EP300, ERBB2, FBXW7, HRAS, KRAS, MAPK1, NFE2L2, PTEN, STK11 and TERT promoter) were analyzed. A total of 11 sequence changes in 10 patients were detected using HRM method (in CTNNB1 FBXW7 and PTEN gene and in TERT promoter). In three patients, sequence changes were confirmed and identified by Sanger sequencing, namely in one patient in FBXW7 gene and in two patients in PTEN gene. The results of the mutational screening were then combined with the pilot study by Wayhelova et al. (2016), who analyzed the presence of mutations in the mutational hot spots of EGFR, KRAS, PIK3CA and TP53 genes in the same samples. Altogether, 21 sequence changes in six genes (CTNNB1, FBXW7, KRAS, PIK3CA, PTEN and TERT promoter) were detected in 16 patients in both mutational analysis. Sequence changes were confirmed and identified by Sanger sequencing in five patients, in two patients in PIK3CA gene (M1043I and N1044D mutations in one patient and E542K and D549N mutations in the other patient), in one patient in FBXW7 gene (R505G mutation) and in two patients in PTEN gene (E157fs and Y138D mutations, each in one patient). The results of the mutational analysis were further evaluated in the context of clinical and molecular-cytogenetic data of the patients. Association of the occurence of sequence changes in KRAS gene with adenocarcinoma and HPV negativity was detected, as well as association of sequence changes in this gene with poorer prognosis and a higher probability of disease reccurence. Additionally, relationship between presence of sequence changes in TERT promoter and absence of hTERC amplification was also observed. The obtained results confirmed the role of gene mutations in the development of cervical carcinoma and their possible use as prognostic factors.

Keywords

cervikální karcinom, HPV, mutace, HRM, Sangerovo sekvenování, cervical carcinoma, mutation, Sanger sequencing

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 21. 6. 2018
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Medical Genetics and Molecular Diagnostics