Detekce minimální residuální choroby u mnohočetného myelomu

Bc. Lenka Sedlaříková, Ph.D.

Master's thesis

Detection of minimal residual disease in multiple myeloma

Abstract:

Mnohočetný myelom (MM) je nádorové lymfoproliferativní onemocnění terminálních stádií B lymfocytů, které je charakterizováno expanzí monoklonálních plazmatických buněk (PB). Jde o druhé nejčastější hematoonkologické onemocnění. V dnešní době, s nástupem nových léků, se MM stal obtížně léčitelným onemocněním. Cílem léčby je dosažení kompletní remise, tedy vymizení klinických příznaků. Nicméně u většiny pacientů nakonec dochází k relapsu onemocnění. Proto je v současnosti pozornost zaměřena na zpřesnění sledování remise i relapsu metodami molekulární biologie. K těm patří i alelově specifická (ASO) PCR a real-time kvantitativní PCR (qPCR) založená na detekci specifické VDJ přestavby genu pro těžký řetězec imunoglobulinu (IgH) u klonálních PB. Při detekci minimální residuální choroby (MRD) pomocí PCR u MM je využito především hypervariabilní oblasti přestavby IgH, jejíž sekvence slouží pro návrh primerů a sond specifických pro konkrétní klon nádorových PB pacienta. Tato metoda doplňuje stanovení MRD u MM pomocí průtokové cytometrie, ale nebyla doposud zavedena na žádném pracovišti v ČR. Cílem této diplomové práce tedy bylo zavést metodu detekce MRD pomocí alelově specifické kvalitativní i kvantitativní PCR na vzorcích z kostní dřeně (KD), příp. periferní krve (PK) u pacientů s MM v podmínkách našeho pracoviště. V teoretické části se diplomová práce zabývá charakteristikou MM, popisuje vývoj B lymfocytů s ohledem na toto onemocnění a vysvětluje jednotlivé kroky molekulárně biologické detekce MRD na bázi PCR a její využití v praxi. Experimenty v rámci diplomové práce zahrnovaly optimalizaci jednotlivých kroků metody detekce MRD pomocí PCR včetně zavedení kvalitativní PCR s využitím již známých VH a JH primerů, analýzu sekvencí a detekci pacient-specifických přestaveb, návrh primerů a sond specifických pro pacienty, klonování a přípravu standardních křivek pro qPCR a její zavedení.

Abstract:

Multiple myeloma (MM) is a malignant lymphoproliferative disease of terminally differentiated B lymphocytes characterized by expansion of monoclonal plasma cells. It is the second most common hematological cancer in the world. Recently with the introduction of new drugs, MM has become a hard-to-treat disease. The aim of the treatment is clinical remission and eradication of clinical manifestation. Nevertheless, most of MM patients eventually relapse. For that reason, the attention today is paid to more accurate monitoring of remission and relapse by molecular biologic techniques. One of them is allele-specific (ASO) PCR and a quantitative real-time PCR (qPCR) based on specific detection of clonal cells VDJ immunoglobulin heavy chain (IgH) gene rearrangement. The hypervariable region of IgH rearrangement is used for detection of minimal residual disease in MM as this sequence is used for allele-specific primer and probe design. This technique is a complementary tool for flow cytometry in MRD detection however, it has not been established in the Czech republic so far. The aim of this diploma thesis was to introduce allele-specific qualitative and quantitative detection of MRD by PCR on bone marrow and peripheral blood samples of myeloma patients in our laboratory. The theoretical part of diploma thesis is focused on MM characterization and B cell development considering this disease. It explains individual steps of MRD detection via PCR methods. The experimental part comprises optimalization of these steps including introduction of qualitative PCR with VH and JH consensual primers, analysis of sequences and patient-specific IgH rearrangements, patient-specific primers and probes design, cloning, standard curve preparation and introduction of MRD detection via qPCR.

Keywords

mnohočetný myelom, minimální residuální choroba, ASO PCR, kvantitativní real-time PCR, přestavba genů pro IgH, multiple myeloma, minimal residual disease, real-time quantitative PCR, IgH gene rearrangement

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 5. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 10. 6. 2013
• Supervisor: doc. RNDr. Sabina Ševčíková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics