Vliv inhibitorů ubiquitin-proteazómového komplexu na degradaci proteinů AKAP v průběhu kapacitace kančích spermií

Bc. Adéla Škodová

Master's thesis

Effect of ubiquitin-proteasome complex inhibitors on the degradation of AKAP proteins during capacitation of boar sperm

Abstract:

Proteiny rodiny AKAP (A-kinázu kotvící proteiny) hrají v organismu důležitou roli v regulaci aktivity proteinkinázy A (PKA). Všechny AKAP proteiny se vyznačují schopností vázat se na regulační podjednotky PKA, čímž mohou ovlivňovat aktivitu cAMP/PKA signální kaskády. Díky této své funkci se podílejí i na regulaci mnoha buněčných procesů včetně gamet. Již bylo prokázáno, že u samců jsou AKAP proteiny významně zapojené do regulace motility spermií, dále i do procesů spojených s kapacitací a akrozomální reakcí spermií. Nejvíce zastoupenými proteiny rodiny AKAP v savčích spermiích, a to i kančích, jsou proteiny AKAP4 a AKAP3. Tyto proteiny jsou lokalizovány především v hlavní části bičíku spermie a AKAP3 protein byl prokázán také v akrozomu. Absence proteinu AKAP4 ve spermiích způsobuje sníženou motilitu bičíku, a tím i sníženou fertilitu spermií. Dosud byl popsán mechanismus degradace proteinu AKAP3 pomocí ubiquitin-proteazómového systému (UPS) v průběhu kapacitace spermií a tato degradace proteinu AKAP3 byla nezbytná pro aktivaci PKA. Mechanismus degradace AKAP4 u kančích spermií doposud popsán nebyl. Cílem této diplomové práce bylo vhodnými experimenty ověřit hypotézu, že UPS je během kapacitace kančích spermií v in vitro podmínkách zapojen do degradace proteinu AKAP4, podobně jako u proteinu AKAP3. Detekce proteinu AKAP4 a sledování vlivu inhibice UPS na degradaci AKAP4 během kapacitace kančích spermií probíhalo prostřednictvím metody Western blot. Imunofluorescenční metodou byla sledována lokalizace proteinu AKAP4 v kančích spermiích. Experimenty provedenými při řešení této diplomové práce byl detekován protein AKAP4 i jeho izoforma proAKAP4, a to jak u ejakulovaných kančích spermií, tak i u spermií po in vitro kapacitaci, a i u spermií po navozené akrozomální reakci. Byla prokázána jeho lokalizace v hlavní části bičíku spermie. Výsledky experimentů zaměřených na sledování zapojení UPS do degradace proteinu AKAP4 během kapacitace kančích spermií potvrdily hypotézu o zapojení UPS do degradace proteinu AKAP4 během kapacitace kančích spermií v in vitro podmínkách. V dalších experimentech by bylo vhodné se zaměřit na sledování aktivity PKA v souvislosti s degradací proteinu AKAP4 během kapacitace kančích spermií.

Abstract:

AKAP family proteins (A-kinase anchoring proteins) play an important role in organism in regulating protein kinase A (PKA) activity. All AKAP proteins are characterized by the ability to bind to PKA regulatory subunits, which may affect the activity of the cAMP/PKA signaling cascade. Thanks to this function, they are also involved in the regulation of many cellular processes, including gametes. In males, AKAP proteins have already been shown to be significantly involved in the regulation of sperm motility, as well as in the processes associated with capacitation and acrosomal reaction of sperm. The most abundant proteins of the AKAP family in mammalian sperm, including boar sperm, are the AKAP4 and AKAP3 proteins. These proteins are located mainly in the principal piece of the sperm flagellum and the AKAP3 protein has also been shown in the acrosome. The absence of protein AKAP4 in sperm causes reduced flagellar motility and thus reduced sperm fertility. To date, the mechanism of AKAP3 protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) during sperm capacitation has been described and this degradation of protein AKAP3 was necessary for activation PKA. The mechanism of AKAP4 degradation in boar sperm has not been described to date. The aim of this diploma thesis was to verify the hypothesis that the UPS is involved in the degradation of AKAP4 protein during in vitro conditions during the capacitation of boar sperm, similarly to AKAP3 protein. Detection of AKAP4 protein and monitoring of the effect of UPS inhibition on AKAP4 degradation during boar sperm capacitation was performed by Western blot. The localization of AKAP4 protein in boar sperm was observed by immunofluorescence method. AKAP4 protein and its isoform proAKAP4 were detected by experiments performed in solving this diploma thesis in ejaculated boar sperm, as well as in sperm after in vitro capacitation and also in sperm after induced acrosomal reaction. Has been demonstrated localization of protein in principal piece of sperm flagellum. The results of experiments aimed at monitoring the effect of the UPS on the degradation of AKAP4 protein during capacitation of boar sperm confirmed hypothesis of involvement UPS in the degradation of AKAP4 protein during the capacitation of boar sperm in vitro. In further experiments, it would be appropriate to focus on monitoring PKA activity in relation to AKAP4 protein degradation during boar sperm capacitation.

Keywords

AKAP4, kančí spermie, kapacitace, proteazom, ubiquitin

Keywords

boar sperm, capacitation, proteasome, ubiquitin, AKAP4

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Ing. Tereza Krejčová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology