Detekcia metylačných zmien v DNA nádorových buniek

Bc. Natália PODHORSKÁ

Master's thesis

DNA methylation changes detection in cancer cells

Abstract:

Aberantná epigenetická metylácia DNA sa pravdepodobne vyskytuje už v počiatočnom štádiu neoplastického vývoja a považuje sa za relevantný faktor pri iniciácii a progresii rakoviny. Detekcia metylácie DNA sa tak stala dôležitým prístupom pre štúdium génovej regulácie a má potenciálnu aplikáciu v diagnostike tohto ochorenia. Metódy PCR na báze bisulfitovej konverzie ako je PCR spojená s nasledným bisulfitickým sekvenovaním (BSP) a metyl-špecifická PCR (MSP), zostávajú najčastejšie používanými metódami na detekciu metylácie. Teoretická časť tejto práce sa zameriava na popis mechanizmu DNA metylácie, jej vznik a vplyv na expresiu dôležitých génov. Ďalej je v tejto práci popísaný vplyv metylácie na vznik a rozvoj karcinogenézy. Ďalšia kapitola popisuje možnosti liečby nádorov pomocou demetylačných liečiv decitabínu a azacytidínu, mechanizmus ich aktivácie, inkorporácie do nukleových kyselín a rezistencie. Táto časť práce poskytuje tiež náhľad na možný objav predpokladaných rakovinových biomarkerov pre včasnú detekciu, monitorovanie ochorenia, prognózu a stručný princíp ich detekcie pomocou priameho bisulfitového sekvenovania a formáty súborov použitých pre analýzu sekvenačných dát v praktickej časti práce. Praktická časť práce popisuje detekciu DNA metylačných profilov pomocou využitia PCR v reálnom čase s nasledovným bisulfitickým sekvenovaním na platforme Illumina a ďalej spracovanie sekvenačných dát vrátane metylačnej kvantifikácie. Hlavným cieľom tejto práce bolo detekovať a identifikovať metylované oblasti, najmä CpG ostrovov v transkripčných počiatkoch promótorov alebo prvých exónoch vybraných génov, v genómoch bunkovej línie HCT116 odvodenej z rakovinových buniek kolorekta, ktoré môžu hrať dôležitú úlohu pri indukovaní sekundárnej rezistencie na demetylačné činidlá decitabín a azacytidín, používané hlavne na liečbu myelodisplastických syndrómov a akútnej myeloidnej leukémie (AML). Pri testovaní 14 génov sme z výsledkov analýzy zistili, že metylácia v 6 upregulovaných génoch, vystupujúcich ako onkogény, nemala vplyv na reguláciu ich expresie a vznik sekundárnej rezistencie voči decitabínu. Z toho 5 tumor-supresorových génov bolo downregulovaných a vykazovalo značné zmeny metylácie a teda sa v určitej miere podieľajú na vzniku sekundárnej rezistencie voči decitabínu. Najvýraznejšie metylačné zmeny sa nám podarilo sledovať pri onkogéne IL32, ktorý je v rakovinových bunkách upregulovaný a zrejme teda zohráva úlohu pri vzniku sekundárnej rezistencie. Avšak, 2 gény z analýzy vypadli z dôvodu nehodnotiteľných dát a preto je potrebný ich ešte ďalší výskum.

Abstract:

Aberrant epigenetic DNA methylation probably already occur at early stage in neoplastic development, and it is considered to be a relevant factor in cancer initiation and progression. Detection of DNA methylation has thus become an important approach for studying gene regulation and has potential application in diagnostic of this disease. Bisulfite-conversion-based PCR methods, such as bisulfite-sequencing PCR (BSP) and methylation-specific PCR (MSP), remain the most commonly used techniques for methylation detection. Theoretical part of this thesis is focused on the description of the mechanism of DNA methylation, its formation and influence on the expression of important genes. In addition, this paper describes the effect of methylation on the initiation and promoting of carcinogenesis. Another chapter describes the possibilities of tumor treatment by demethylating agents, mechanism of their activation, incorporation into nucleic acids and resistance. Further chapters provides insight into the possible discovery of putative cancer biomarkers for early detection, disease monitoring, prognosis and a brief principle of their detection using direct bisulfite sequencing and sets of formats used for sequence data analysis in the practical part of the work. Experimental part of the thesis describes the detection of DNA methylation profiles by using Real-time PCR with subsequent bisulfite-sequencing on platform Illumina and further sequential data processing including methylation quantification. The main aim of this thesis was to detect and identify methylated regions, of particular CpG islands in the transcriptional start points of promoters or first exons of selected genes, in genomes of the HCT116 cell line derived from cancerous colorectal cells, which can play an important role in inducing secondary resistance to demethylating agents decitabine and azacytidine, used primarily for the treatment of myelodysplastic syndromes and for acute myeloid leukemia (AML). From the analysis, where we tested 14 genes, we found that the methylation in 6 upregulated genes emerging as oncogenes did not affect the regulation of their expression and secondary resistance to decitabine. Of these, 5 tumor-supressor genes were downregulated and showed significant changes in methylation, and thus contributed to a certain extent to the secondary resistance to decitabine. The most significant methylation changes have been observed in IL32 oncogene, which is upregulated in cancer cells and thus appears to play a role in secondary resistance formation. However, 2 genes have been fallen out of analysis due to unquantifiable data, so further research is needed.

Keywords

metylácia DNA, rezistencia, decitabin, azacytidin, rakovina

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Rastislav Slavkovský, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology