Biochemical and structural insights into PIN-mediated auxin transport

Yewubnesh Seifu Wendimu, MSc

Disertační práce

Anotace:

PIN proteiny vytvářejí koncentrační gradient auxinu, který koordinuje růst rostlin. PIN1-4 a 7 jsou lokalizovány na plazmatické membráně (PM) a usnadňují polární transport tohoto rostlinného hormonu, zatímco PIN5 a PIN8 lokalizované v endoplazmatickém retikulu (ER) udržují jeho nitrobuněčnou homeostázu. Ačkoli jejich antagonistická při regulaci nitrobuněčné distribuce auxinu a dalších vývojových aspektech byla popsána, způsob, jakým tyto dva proteiny nacházející se ve stejném nitrobuněčném kompartmentu (ER), fungují proti sobě, zůstává nejasný. Pomocí imunolokalizace, pH-dependentního zhášení fluorescence a programů predikce topologie jsem zmapovala membránovou topologii PIN5 a PIN8 v buňkách kořene Arabidopsis thaliana. Studie ukazuje, že kromě podobností v orientaci N-konce mají PIN5 a PIN8 opačnou orientaci centrální hydrofilní smyčky (HS) a C-konce, a také rozdílný počet transmembránových domén (TMD). PIN8 má deset TMD se skupinami pěti alfa-helixů oddělených centrální HS směřující do ER lumenu zatímco jeho N- a C-konce jsou umístěny v cytoplazmě. Topologie PIN5 však představuje devět TMD, kdy N-konec a centrální HL směřují k cytoplazmě, zatímcoC-konec k lumenu ER. Rozdílná membránová topologie PIN5 a PIN8 může odrážet jejich protichůdnou aktivitu při regulaci vývojových událostí. Ve srovnání s divokým typem byl u mutantu pin5-5 výrazně vyšší počet primordií laterárních kořenů (PLR) a hustota laterárních kořenů (LK).Exprese fúzí PIN5-GFP křížených s pin5-5 však vedla ke snížení jak počtu LRP, tak hustoty LR mutantu na úroveň divokého typu, což naznačuje, že PIN5 může být negativním regulátorem vývoje LK. PIN8 naopak hustotu LK podporuje. To ukazuje, že oba proteiny mohouvývoj LK antagonizovat. Mutant pin5-5 je defektní v prodlužování kořenových vlásků při reakci na auxin. Kořenový vlásky mutanta pin8-1 však připomínají fenotyp divokého typu. Protichůdná aktivita PIN5 při regulaci vývoje LK a prodlužování kořenových vlásků také naznačuje, že PIN5 reguluje tyto vývojové aspekty prostřednictvím odlišných mechanismů.

Abstract:

PIN proteins establish auxin concentration gradient, which coordinates plant growth. PIN1-4 and 7 are localized at the plasma membrane (PM) and facilitate polar auxin transport while the endoplasmic reticulum (ER) localized PIN5 and PIN8 maintain the intracellular auxin homeostasis. Although an antagonistic activity of these proteins in controlling the intracellular auxin homeostasis and other developmental aspects have been reported, how the two proteins, which localise in the same intracellular compartment (endoplasmic reticulum), oppose one another remain unclear. Using immunolocalization, pH-dependent fluorescent quenching, and topology prediction programs, I mapped the membrane topology of PIN5 and PIN8 in Arabidopsis thaliana root cells. The study indicates that, except for the similarities in the orientation of the N-terminus, PIN5 and PIN8 have an opposite orientation of the central hydrophilic loop and the C-terminus, as well as an unequal number of transmembrane domains (TMDs). PIN8 has ten TMDs with groups of five alpha-helices separated by the central hydrophilic loop (HL) residing in the ER lumen, and its N- and C-terminals are positioned in the cytoplasm. However, topology of PIN5 comprises nine TMDs. Its N-terminal end and the central HL face the cytoplasm while its C-terminus resides in the ER lumen. The divergent membrane topology of PIN5 and PIN8 may reflect their opposing activity in mediating developmental events. In comparison to the WT, the number LRP and LR density was significantly higher in the pin5-5 mutant. However, expression of PIN5-GFP fusions in the pin5-5 background decreased both the number of LRP and LR density of the mutant to the WT level, indicating that may be PIN5 is a negative regulator of lateral root development. In contrast to PIN5, PIN8 promote lateral root density. This indicate that both proteins may be antagonise lateral root development. The pin5-5 mutant is defective in auxin responsive root hair elongation. However, the pin8-1 mutant’s root hair resembles wild type phenotype. The countering activity of PIN5 in regulating lateral root development and root hair elongation also indicate that PIN5 regulates these developmental aspects may be through distinct mechanisms.

Keywords

Klíčová slova, Arabidopsis thaliana, homeostáza auxinu, transport auxinu, endoplazmatické retikulum, membránová topologie, přenašeči efluxu auxinu PIN, postranní toots, kořenové vlásky. Keywords, auxin homeostasis, auxin transport, endoplasmic reticulum, membrane topology, PIN auxin efflux carriers, lateral toots, root hairs.

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 3. 12. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 1. 2025
• Vedoucí: B.A. Tomasz Nodzynski, M.Sc.
• Oponent: Mgr. Markéta Pernisová, Ph.D., Dipl.-Ing. Dr. Verena Ibl, Mgr. Jozef Mravec, PhD

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Vědy o živé přírodě / Vědy o živé přírodě