Optimalizace TR-FRET stanovení intracelulárního cAMP v lidských neutrofilech ovlivněných forskolinem a jeho deriváty

Bc. Adéla Hronová

Bachelor's thesis

Optimization of TR-FRET measurement of intracellular cAMP in human neutrophils treated with forskolin or its derivatives

Anotácia:

Tato práce se zabývá optimalizací stanovení intracelulárního cyklického AMP (cAMP) metodou TR-FRET v lidských neutrofilech, ve kterých koncentrace cAMP moduluje jejich antimikrobiální procesy zahrnující adhezi, chemotaxi a oxidační vzplanutí. cAMP je v buňkách tvořen z ATP enzymem adenylylcyklázou (AC) a jedná se o významného sekundárního posla v buněčné signalizaci. Aktivita AC je stimulována forskolinem a jeho deriváty. Metoda TR-FRET je založena na kompetici mezi cAMP značeným chelátem europia a cAMP ve zkoumaném vzorku o vazebné místo na cAMP specifických monoklonálních protilátkách značených Ulight barvivem. V experimentální části byl testován vhodný počet buněk pro měření cAMP, vliv média s Ca2+ a účinnost forskolinu, colforsinu, 7-deacetyl-forskolinu (7DA-FSK) a 1,9-dideoxy-forskolinu (dd-FSK) na stimulaci produkce cAMP. Z výsledků vyplývá, že forskolin a colforsin mají srovnatelný účinek na aktivaci AC neutrofilů, zatímco 7DA-FSK má nižší a dd-FSK téměř žádný účinek na modulaci činnosti AC. Zkoumání regulace aktivity AC na produkci cAMP má potenciální terapeutické uplatnění.

Abstract:

In this thesis we studied the optimization of the determination of intracellular cyclic AMP (cAMP) by TR-FRET in human neutrophils, in which cAMP levels modulate antimicrobial mechanisms including adhesion, chemotaxis and respiratory burst. cAMP is synthesized from ATP by an enzyme adenylyl cyclase (AC) in the cells and it is one of the most important second messenger in cell signalling. AC activity is stimulated by forskolin and its derivatives. TR-FRET assay is based on the competition between the europium chelate-labeled cAMP tracer and sample cAMP for binding site on cAMP-specific monoclonal antibodies labeled with the Ulight dye. In experimental part we tested optimal cell density for measuring cAMP, influence of medium with Ca2+ and efficacy of forskolin, colforsin, 7-deacetyl-forskolin (7DA-FSK) and 1,9-dideoxy-forskolin (dd-FSK) for stimulation of cAMP production. The results indicate that forskolin and colforsin have a comparable effect on the activation of AC in neutrophils, while 7DA-FSK displays decreased and dd-FSK almost no effect on the modulation of AC activity. Examination of regulating the AC activity to produce cAMP has potential therapeutic applications.

Kľúčové slová

Adenylylcykláza, Neutrofil, cAMP, Forskolin, TR-FRET, Adenylyl cyclase, Neutrophil

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 5. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 13. 6. 2016
• Vedúci: Mgr. Tomáš Perečko, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry