Biochemická charakterizace rekombinantní S-nitrosoglutathionreduktasy z Brassica oleracea a Lactuca sativa

Bc. Tereza TICHÁ

Diplomová práce

Biochemical characterization of recombinant enzyme S-Nitrosoglutathione reductase from Brassica oleracea and Lactuca sativa

Anotace:

Diplomová práce je zaměřena na studium rostlinné S-nitrosoglutathionreduktasy (GSNOR) náležící do rodiny alkoholdehydrogenas třídy III (EC 1.1.1.1). Enzym je rovněž znám jako S-(hydroxymethyl)glutathiondehydrogenasa (EC 1.1.1.284) díky katalýze NAD+-dependentní oxidace S-(hydroxymethyl)glutathionu (HMGSH). Za fyziologicky významnější je považována katalýza NADH-dependentní redukce S-nitrosoglutathionu (GSNO), ovlivňující celkový metabolismus reaktivních forem dusíku v buňkách. GSNOR představuje klíčový regulátor nejen metabolismu S-nitrosothiolů, ale plní svou funkci v obranné reakci na abiotické a biotické stresové faktory. V první části experimentální práce byly charakterizovány molekulové a kinetické vlastnosti rekombinantních enzymů GSNOR z Brassica oleracea var. botrytis (BoGSNOR) a Lactuca sativa UCDM2 (LsGSNOR). Oba byly heterologně exprimovány v E. coli jako N-terminální proteiny nesoucí 6xHis-Tag a purifikovány metodou chelatační chromatografie. BoGSNOR složená z 379 aminokyselin a LsGSNOR složená z 377 aminokyselin se vyskytují v nativní formě jako dimery a vykazují vysokou teplotní stabilitu. Ačkoliv byla u obou enzymů pozorována široká substrátová specifita pro řadu alkoholů s vyšším počtem uhlíků a omega-hydroxymastných kyselin v přítomnosti NAD+, preferují jako hlavní substráty GSNO a HMGSH. U nekompetitivního inhibitoru N6022 byla prokázána vysoká inhibiční schopnost (IC50 BoGSNOR = 321 nM), u ostatních inhibitorů byly hodnoty IC50 o 1-2 řády vyšší. V druhé části experimentální práce, zabývající se řešením role GSNOR v průběhu patogeneze, byly sledovány změny aktivity enzymu u modelového patosystému Bremia lactucae x Lactuca spp., tvořeného pěti genotypy s odlišnou rezistencí vůči patogenu.

Abstract:

The thesis is focused on the study of plant S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR) belonging to the family of class III alcohol dehydrogenases (EC 1.1.1.1). The enzyme is also known as S-(hydroxymethyl)glutathione dehydrogenase (EC 1.1.1.284) due to catalysis NAD+-dependent oxidation of S-(hydroxymethyl)glutathione (HMGSH). Physiologically more important is NADH-dependent reduction of S-nitrosoglutathione (GSNO), which can affecting the overall cellular metabolism of reactive nitrogen species. GSNOR is not only a key regulator of metabolism of the S-nitrosothiols, but performs its function in a defense responses to abiotic and biotic stress. In the first part of the experimental work were characterized molecular and kinetic properties of the recombinant enzyme GSNOR from Brassica oleracea var. botrytis (BoGSNOR) and Lactuca sativa UCDM2 (LsGSNOR). Both were heterologous expressed in E. coli as N-terminal proteins carrying 6xHis-Tag and purified by chelating chromatography. Both, BoGSNOR composed of 379 amino acids and LsGSNOR composed of 377 amino acids, occur in native form as a dimers and exhibit high thermal stability. Although both enzymes showed a broad substrate specificity for a long-chain alcohols and omega-hydroxyfatty acids in the presence of NAD+, they prefer as the main substrates GSNO and HMGSH. The non-competitive inhibitor N6022 was found to have a high inhibitory capacity (IC50 BoGSNOR = 321 nM), other inhibitors showed the IC50 values higher by 1-2 orders of magnitude. Also was solved the role of GSNOR during pathogenesis. As the model pathosystem served Bremia lactucae x Lactuca spp., consisting of five genotypes with different resistance to the pathogen.

Klíčová slova

Oxid dusnatý, S-nitrosoglutathionreduktasa, patogeneze

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 4. 2013

Zveřejnit od: 26. 4. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 27. 5. 2013
• Vedoucí: Doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie