Interaktomika: Kombinace přístupů in vitro a in silico

Mgr. Petr Lapčík, Ph.D.

Doctoral thesis

Interactomics: Combined in vitro and in silico approaches

Abstract:

Proteiny katalyzují všechny důležité buněčné procesy. Většina proteinů vykonává své funkce ve spojení s dalšími proteiny jako část proteinových komplexů, které v buňce tvoří komplexní interakční síť zvanou interaktom. Znalost složení proteinových komplexů umožňuje objasnit biologické funkce jednotlivých proteinů. Hlavním cílem této práce je identifikace metastatických biomarkerů in silico analýzou transriptomických profilů tumorů prsu, zavedení metodiky globálního mapování proteinových komplexů k charakterizaci molekulárních procesů asociovaných s pro-metastatickými mechanismy a funkční analýzy vybraných proteinů hrajících úlohu ve vzniku metastáz nádorů prsu včetně identifikace interagujících proteinů in vitro v kombinaci s analýzou molekulárních drah in silico. Teoretická část práce se zabývá nádorovými onemocněními prsu a ledvin a popisuje principy transkriptomického a proteomického výzkumu nádorových onemocnění. Samostatná kapitola je věnována proteinovým komplexům a metodám jejich studia, včetně detailního popisu metody SEC-PCP-SILAC umožňující detekci tisíců proteinových interakcí a jejich změn v jednom experimentu. Závěr teoretické části je věnován metodě C-TAILS určené ke studiu substrátové specifity C-terminálních exopeptidáz. Experimentální část sestává z šesti studií publikovaných v recenzovaných časopisech, tří rukopisů v přípravě a výsledků pilotního C-TAILS experimentu. V první studii jsme se zaměřili na identifikaci mechanismů vzniku metastáz u tumorů prsu luminálních A analýzou veřejně dostupného transkriptomického datasetu metodou GSEA. Identifikovali jsme asociaci mezi výskytem uzlinových metastáz a NF-κB dráhou, zatímco vznik vzdálených metastáz je spojen s mechanismy buněčného cyklu, trombolýzy a imunitní odpovědi. Ve druhé studii jsme demonstrovali závislost mezi biologickou rolí proteinu transgelin a molekulárním prostředím v různých buněčných nádorových liniích. Třetí studie se zabývá identifikací interakčních partnerů proteinu AGR2, u kterého byly detekovány především interakce s proteiny podílejících se na skládání proteinů a v mitochondriálních metabolických drahách, včetně proteinů PDIA3 a PDIA6. Čtvrtá, pátá a šestá studie jsou zaměřeny na studium proteinů DSC1 a COMT, u kterých jsme zjistili spojení se zvýšením metastatického potenciálu trojitě-negativních tumorů prsu. Zkoumali jsme role těchto proteinů také v buněčné linii odvozené od luminálního A tumoru prsu pomocí transkriptomických, proteomických a funkčně-biologických technik. U proteinu DSC1 jsme potvrdili jeho pro-metastatickou roli, COMT naopak u luminální A buněčné linie vykazoval tumor-supresorovou funkci. U těchto proteinů jsme se také zaměřili na identifikaci proteinových interakčních partnerů, které v případě DSC1 představují proteiny podílející se na buněčné adhezi a proliferaci, a v případě COMT zahrnují c-Met inhibitor SPINT2. V sedmé studii jsme aplikovali metodu SEC-PCP-SILAC ke studiu změn proteinových komplexů ve vztahu k aktivitě NF-κB dráhy. Její inhibice v nádorových buňkách prsu vede ke změně složení proteinových komplexů podílejících se na celé řadě biologických procesů, včetně regulace imunitní odpovědi, buněčného cyklu a metabolických drah. V osmé a deváté studii jsme pomocí kvantitativní proteomiky zjistili spojení proteinu transgelin s rezistencí renálních tumorů vůči léčbě sunitinibem, a vygenerovali jsme na základě 178 tkáňových vzorků knihovnu proteomických assays pro cílenou kvantifikaci proteinů v renálních karcinomech. Nakonec jsme optimalizovali a aplikovali metodiku C-TAILS, pomocí níž jsme identifikovali protein NPM1 jako možný substrát karboxypeptidázy CPB1, která

Abstract:

je zapojená do pro-metastatických mechanismů nádorů prsu. Výsledky této práce rozšiřují poznatky o molekulárních mechanismech podílejících se na tvorbě metastáz. Studované mechanismy představují potenciální anti-metastatické cíle, pochopení těchto molekulárních mechanismů by tedy mohlo vést k navržení nových přístupů biologické léčby nádorových onemocnění.

Abstract:

Proteins catalyse all important cellular processes. Most proteins perform their functions in connection with other proteins as a part of protein complexes that form a complex interaction network termed as interactome. Knowledge of the protein complex composition enables clarification of biological functions of individual proteins. The main goal of this work is identification of metastatic biomarkers using in silico analysis of breast tumor transcriptomics profiles, implementation of global mapping of protein complexes for deep characterisation of molecular processes associated with pro-metastatic mechanisms, and functional analysis of selected proteins that play a role in breast cancer metastasis, including identification of interacting proteins in vitro in combination with in silico molecular pathway analysis. The theoretical part is focused on breast and renal cancers and describes the principles of transcriptomics and proteomics cancer research. A separate chapter is devoted to protein complexes and methods of their study, including a detailed description of the SEC-PCP-SILAC method enabling the detection of thousands of protein interactions and their changes in one experiment. The final chapter of the theoretical part describes the C-TAILS method designed to study the substrate specificity of C-terminal exopeptidases. The experimental part comprises of six studies published in peer-reviewed journals, three manuscripts in preparation and the results of a pilot C-TAILS experiment. In the first study, we focused on the identification of metastatic mechanisms in luminal A breast tumors using the GSEA analysis of a publicly available transcriptomics dataset. We identified an association between the lymph node metastasis and the NF-κB pathway, whereas development of distant metastases is associated with cell cycle mechanisms, thrombolysis, and the immune response. In the second study, we demonstrated the relationship between the biological role of transgelin and the molecular environment in different cancer cell lines. The third study concerns with identification of interaction partners of protein AGR2 that mainly include proteins involved in protein assembly and mitochondrial metabolic pathways, including protein PDIA3 and PDIA6. The fourth, fifth and sixth studies focus on DSC1 and COMT proteins, for which we identified an association with increased metastatic potential of triple-negative breast tumors. We also investigated roles of these proteins in luminal A breast cancer cell line using transcriptomics, proteomics, and functional-biology techniques. We confirmed the pro-metastatic role of DSC1, on the other hand, COMT showed tumor-suppressor functions in luminal A breast cancer cells. Moreover, we focused on identification of protein interaction partners of these proteins, which for DSC1 involve proteins participating in cell adhesion and proliferation, and for COMT include c-Met inhibitor SPINT2. In the seventh study, we applied the SEC-PCP-SILAC method to study changes in protein complexes in relation to the NF-κB pathway. Its inhibition in breast cancer cells leads to changes in composition of protein complexes involved in a variety of biological processes, including regulation of immune response, cell cycle and metabolic pathways. In the eighth and ninth studies, we used quantitative proteomics to determine the association of transgelin protein with renal tumor resistance to sunitinib treatment, and we generated a library of proteomics assays for targeted protein quantification in renal carcinoma tissues based on 178 tissue specimens. Finally, we optimized and applied the C-TAILS method, and we identified the NPM1 protein as a potential substrate of the carboxypeptidase CPB1 that is involved in pro-metastatic mechanisms of breast tumors. Results of this work supplement findings regarding the molecular mechanisms involved in cancer metastasis. Studied mechanisms represent potential anti-metastatic targets, understandin

Abstract:

g of these mechanisms could thus lead to proposal of new approaches of biological cancer treatment.

Keywords

proteomics, interactomics, breast cancer, renal cancer, SEC-PCP-SILAC, DDA, DIA, pull-down, metastasis, GSEA

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 3. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 28. 4. 2022
• Supervisor: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.
• Reader: doc. Mgr. Jan Bouchal, Ph.D., RNDr. Marek Vrbacký, PhD.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry