Aplikace kvantitativní obrazové analýzy pro studium buněčné odpovědi na DNA poškození

Mgr. Eva VESELÁ

Doctoral thesis

Abstract:

DNA damage response (DDR) is a complex signalling network important for maintenance of DNA stability. Disrupted DDR was proposed to contribute to mutagenesis, carcinogenesis, induction of apoptosis and senescence. Here, the dynamics of DDR proteins, MDC1, 53BP1 and FANCD2 are evaluated in live cells in response to localised DNA damage generated by laser micro-irradiation (LMI). A new approach of LMI performed on laser scanning microscope was tested and software for automated quantitative image analysis was developed. The method presented here possess several advantages compared to commonly used approaches to LMI: it is faster and the DNA damage is induced in a regular pattern of collinear stripes that enabled development of automated quantitative image analysis software routine. The method was tested to be usable also for other photo-manipulation technique called fluorescence recovery after photo-bleaching (FRAP), and for immunofluorescent detection of DDR markers. The method provides an easy and unbiased evaluation of sufficient numbers of cells for robust statistical analysis and facilitates the use of LSM techniques for high-content screening. In the second part of the thesis, image analysis was used to elucidate the role of XPC protein in cellular response to replication stress (RS). Several markers of DDR were evaluated in particular phases of the cell cycle. XPC was suggested to be involved in early stages of cellular response to RS. XPC may facilitate recruitment of particular DDR proteins and thus contribute to successful DDR signalling.

Abstract:

Soubor komplexních signálních drah zajišťující rozpoznání, signalizaci a opravu DNA poškození se souhrnně nazývá odpověď na DNA poškození. Tyto dráhy jsou nezbytné pro udržování stability genomu. Narušení těchto drah přispívá k mutagenezi, karcinogenezi, apoptóze a senescenci. V předkládané práci byla v živých buňkách měřena dynamika odpovědi na lokalizované DNA poškození tří proteinů: MDC1, 53BP1 a FANCD2. Lokalizované DNA poškození, tzv. laserová mikroiradiace (LMI), bylo indukováno pomocí laserového skenovacího mikroskopu. V práci je představen nový způsob iradiace vzorků, který má několik výhod oproti běžně používaným technikám LMI: DNA poškození je generováno rychleji a má pravidelnou strukturu souběžných pruhů, která umožňuje vyhodnocení pomocí automatizované obrazové analýzy. Metodu je možné využít také pro další foto-manipulační techniku FRAP a pro imunofluorescenční detekci markerů DNA poškození. Metoda umožňuje jednoduché a objektivní vyhodnocení dostatečného počtu vzorků pro robustní statistickou analýzu a představuje tak značné usnadnění využití laserové skenovací mikroskopie pro high-content screening. V druhé části této práce byla převážně pomocí kvantitativní obrazové analýzy studována role XPC proteinu v odpovědi na replikační stres. Bylo vybráno několik specifických markerů účastnících se odpovědi tento typ DNA poškození a jejich lokalizace do míst poškození byla vyhodnocena ve vybraných fázích buněčného cyklu. Výsledky ukazují, že XPC protein by mohl hrát roli v raných fázích odpovědi na DNA poškození. XPC pravděpodobně usnadňuje vazbu dalších proteinů, čímž přispívá ke správné a dostatečné aktivaci signálních drah aktivovaných DNA poškozením.

Keywords

rozpoznání DNA poškození, oprava DNA poškození, lokalizované ozáření laserem, obrazová analýza, mikroskopie, reportérové buněčné linie, XPC, HCS, rakovina

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 7. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 12. 9. 2017

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Genetics / Medical Genetics