Využití metody CRISPR pro manipulaci savčích buněk

Bc. Tomáš Gybeľ

Bachelor's thesis

CRISPR technology for manipulation of mammalian cells

Abstract:

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated proteins) is a system of adaptive immunity in bacteria which has been transformed into a genetic engineering tool, the CRISPR/Cas method. Since demonstration of its applicability in targeted genetic engineering of mammalian cells in 2012, through the first use for editing of human embryo in 2015, to the present day, CRISPR/Cas has been significantly improved and adapted, and now is forming a large CRISPR toolkit usable not only for genetic manipulations. This bachelor thesis provides a broad overview of methods and approaches based on the CRISPR method that can be applied in manipulations of mammalian cells. The overview begins with usage of the technology CRISPR/Cas9 for creating knock-outs, followed by description of the modifications leading to perfect repair by homologous recombination to description of robust applicability of CRISPR interference from the regulation of expression of one gene to complex multiple gene programs. CRISPR/Cas reaches beyond the field of genetic manipulations in described applications such as live cell imaging and chromatin immunoprecipitation. Penultimate chapter of the work is connected with CRISPR libraries, enabling genome-wide screens, and the thesis ends with a description of an alternative, perhaps even successor of Cas9 nuclease, which is nuclease Cpf1 of class 2 CRISPR/Cas system.

Abstract:

CRISPR (z angl. clustered regularly interspaced short palindromic repeats; sdružené pravidelně rozmístněné krátké palindromatické repetice)/Cas (z ang. CRISPR-associated proteins; CRISPR-asociované proteiny) je systém adaptivní imunity u baktérií, který byl modifikovaný v nástroj genetického inženýrství, metodu CRISPR/Cas. Za krátké období od prokázání její využitelnosti v cíleném genetickém inženýrství savčích buněk v roku 2012, přes její prvé použití na lidských embryích v roku 2015, až po dnešní den, prošla metoda CRISPR/Cas významnými vylepšeními a adaptacemi, které v současnosti tvoří rozsáhlý „CRISPR toolkit“, použitelný nejen pro genové manipulace. Tato práce nabízí širší přehled metod a přístupů založených na metodě CRISPR/Cas, které je možné aplikovat v manipulacích se savčími buňkami. Přehled začíná využitím technologie CRISPR/Cas9 pro tvorbu knock-outů, následuje popis modifikací vedoucích k dokonalé opravě homologní rekombinací, až po náčrt zvyšující se aplikovatelnosti CRISPR interference, od regulace exprese jednoho genu po komplexní multigenové programy. Za hranice genových manipulací se technologie CRISPR/Cas dostává v popsaných aplikacích jako je „live cell imaging“ nebo chromatinová imunoprecipitace. Závěrem se práce věnuje CRISPR knihovnám, umožňujícím celogenomové skríningy, a končí popisem alternativy, možno dokonce nástupce nukleázy Cas9, kterým je nukleáza Cpf1 z CRISPR/Cas systému třídy 2.

Keywords

CRISPR/Cas, Cas9, gRNA (sgRNA), dead Cas9 (dCas9), nikáza Cas9 (Cas9n), CRISPR interference (CRISPRi), knock-out (KO), NHEJ, HDR CRISPR/Cas, CRISPR interferencia (CRISPRi), nickase Cas9 (Cas9n), HDR

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 8. 6. 2016
• Supervisor: RNDr. Vendula Pospíchalová, PhD.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics