Telomery a telomerový chromatin v kalusech rostlin Arabidopsis thaliana kultivovaných v přítomnosti epigeneticky aktivní látky

Bc. Klára Konečná

Diplomová práce

Telomeres and telomeric chromatin in Arabidopsis thaliana calli cultivated in the presence of epigenetically active drug

Anotace:

Epigenetika je vědní obor studující změny exprese genů (obecně změny struktury chromatinu) nesouvisející se změnou primární struktury DNA. Tyto mechanismy jsou realizovány především methylací cytosinů v DNA a modifikacemi histonů. Těmto modifikacím podléhají také telomery – nukleoproteinové struktury na koncích lineárních eukaryotických chromosomů, které chrání vnitřní sekvence genomu před zkracováním během replikace DNA a brání rozpoznání přirozených konců DNA reparačními enzymy. Většina rostlinných druhů má stejnou telomerovou sekvenci jako modelová rostlina Arabidopsis thaliana, tato sekvence je tvořena kanonickou repeticí TTTAGGG/AAATCCC. Bylo zjištěno, že cytosiny v telomerových sekvencích rostlin mohou být methylovány. Jedním ze způsobů, jak je možné studovat methylaci DNA, je genetická nebo chemická inhibice. Chemickou inhibicí může být ovlivněna aktivita DNA methyltransferas; enzymů, které katalyzují methylaci cytosinů v DNA. Mezi chemické inhibitory řadíme DHPA a analogy cytidinu (zebularin, 5-azacytidin a 5 azadeoxycytidin). V praktické části diplomové práce byly studovány tři ekotypy rostliny A. thaliana, a to Columbia, Landsberg erecta a Wassilewskija. Byly analyzovány klíční rostliny, dospělé rostliny a kalusové kultury odvozené z klíčních rostlin, které rostly na kontrolním médiu či v přítomnosti hypomethylační látky – zebularinu. Ve zmíněných vzorcích byla analyzována délka telomer, hladina methylací v centromerových repeticích, modifikace telomerových histonů, výskyt variant rDNA/rRNA a transkripce vybraných transpozonů a ATR a ATM kinas. U kalusů ekotypů Landsberg erecta a Wassilewskija, které rostly na kontrolním médiu, bylo pozorováno postupné prodlužování telomer. Délky telomer kalusů všech tří ekotypů založených ze zebularinem ovlivněných klíčních rostlin a kultivovaných na médiu se zebularinem byly stabilní. Při analýze methylace DNA bylo potvrzeno hypomethylační působení zebularinu, přičemž efekt je závislý na jeho trvalé přítomnosti. Dále bylo zjištěno, že zebularin má vliv na epigenetické modifikace telomerových histonů; v přítomnosti zebularinu došlo k poklesu relativní hladiny heterochromatinové modifikace H3K9me2. Přítomnost zebularinu ani kultivace v kalusové kultuře nemají významný vliv na relativní zastoupení variant rDNA a rRNA. V neposlední řadě bylo zjištěno, že zebularin a kultivace v kalusové kultuře výrazně zvyšují transkripci transpozonů, ale nemají výrazný vliv na transkripci ATR a ATM kinas. Výsledky jsou diskutovány v souvislosti s analogickými experimenty provedenými v rámci naší laboratoře či jinými výzkumnými skupinami, jež studují epigenetický stav telomer.

Abstract:

Epigetics is focused on study of alterations of gene expression (generally of the chromatin structure) which are not related to the change of primary structure of DNA, but to the change of methylation pattern of DNA or modifications of histones. Telomeres – nucleoprotein structures at the ends of linear chromosomes of eukaryotic organisms, are also subjects of epigenetic modifications. Telomeres protect coding sequences of the genome and prevent recognition of natural chromosome ends by complexes of repair enzymes. Most of plant species have the same telomere sequence as a model plant Arabidopsis thaliana, a canonical repeat TTTAGGG/AAATCCC. It has been found that cytosines in the plant telomere sequence can be methylated. One of the ways by which methylation of DNA can be studied is genetic or chemical inhibition. By chemical inhibition, activity of DNA methyltransferases, enzymes which catalyse methylation of cytosines in DNA, can be affected. Chemical inhibitors of DNA methylation include DHPA or analogues of cytidine (zebularine, 5 azacytidine and 5-azadeoxycytidine). In the practical part of the diploma thesis seven days old seedlings, adult plants and callus cultures derived from seedlings of three ecotypes of A. thaliana (Columbia, Landsberg erecta and Wassilewskija) were analysed. Seven days old seedlings, adult plants and callus cultures derived from seedlings were analysed. Seedlings and callus cultures grew on the control medium or in the presence of hypomethylating drug – zebularine, plants were cultivated in the soil. In these samples, length of telomeres, methylation of centromere repeats, modification of telomere histones, rDNA/rRNA variants, transcription of transposons and ATR and ATM kinases were analysed. We observed a gradual telomere extension in the callus culture of Landsberg erecta and Wassilewskija which grew on the control medium; while in calli which were introduced from zebularine-treated seedlings and cultivated in the zebularine presence, telomeres were maintained. In analysis of DNA methylation, the hypomethylating capacity of zebularine was confirmed, the effect was dependent on the permanent presence of the drug. Furthermore, zebularin has been found to influence epigenetic modifications of telomeric histones; in the presence of zebularine the relative level of H3K9me2 heterochromatic mark was decreased. The presence of zebularine or cultivation in callus culture had no effect on representation of rDNA and rRNA variants. Finally, it was found that presence of zebularine and cultivation in the callus culture contributed to the transcriptional activity of transposons but had no significant effect on transcription of ATR and ATM kinases. The results were discussed in the context of analogous experiments performed within our laboratory or other research groups which are focused on study of epigenetic state of telomeres.

Klíčová slova

telomery, epigenetika, methylace DNA, hypomethylační činidla, zebularin, telomeres, epigenetics, DNA methylation, hypomethylating drugs, zebularine

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 5. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 18. 6. 2018
• Vedoucí: doc. Mgr. Miloslava Fojtová, CSc.
• Oponent: doc. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Genomika a proteomika