Studium genové exprese nádorových buněk pomocí DNA čipů

Mgr. Jana Kotašková, Ph.D.

Doctoral thesis

Gene expression analysis of malignant cells using DNA microarrays

Abstract:

Studium genomu, transkriptomu či proteomu v celé jeho komplexnosti si vyžádalo nutnost rozvoje vysokokapacitních, tzv. „high-throughput“ technologií, tedy analýz, kdy je možné v jednom kroku sledovat velké množství molekul a jejich interakcí. Jednou z takových technologií jsou DNA čipy. DNA čipy umožňují analýzu genové exprese tisíců genů a tím srovnávání kompletních expresních profilů buněk, své využití proto často nacházejí při studiu nádorů. DNA čipy jsou s úspěchem využívány při klasifikaci jednotlivých subtypů nádorů na molekulární úrovni, přispívají k odhalování patogeneze nádorových onemocnění nebo umožňují charakterizovat skupiny pacientů s odlišnou odpovědí na terapii či prognózou. Cílem disertační práce bylo zavést tuto metodiku a následně ji využít ke studiu genové exprese nádorových buněk chronické lymfocytární leukemie. Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je lymfoproliferativní onemocnění charakterizované jako monoklonální expanze zralých B-lymfocytů. Mutační status genu pro variabilní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu (IGHV) rozděluje CLL pacienty do dvou prognosticky odlišných skupin. Pomocí DNA čipů jsme provedli analýzu genové exprese CLL buněk s cílem detekovat rozdíly v expresi mezi CLL buňkami s mutovaným a nemutovaným IGHV genem. Dále jsme porovnávali také expresní profily CLL buněk a B-lymfocytů zdravých dobrovolníků. Vzorky CLL pacientů a zdravých dobrovolníků byly testovány pomocí čipů Agilent Human Oligo 1A (v2) Arrays. V případě srovnání exprese zdravých a maligních B-lymfocytů naše výsledky potvrdily některá dříve publikovaná data, jako např. zvýšenou expresi onkogenu WNT3 u CLL nebo sníženou expresi protookogenu LMO2. Výsledkem analýzy CLL buněk s rozdílným mutačním statusem genu pro IGHV byl soubor několika desítek genů, jejichž exprese odlišovala obě prognostické skupiny, přičemž vysoká exprese genů LPL, ZAP70 a LAG3 byla asociována s nemutovaným IGHV. Dále jsme u CLL buněk testovali pomocí kvantitativní RT-PCR expresi setu genů vybraného jednak na základě vlastních čipových analýz a jednak na základě publikovaných prací (LAG3, LPL, ZAP70, AICDA, BCL2, CLLU1, TCF7, SEPT10). Lymphocyte-Activation Gene 3 (LAG3) – jsme identifikovali jako nový potenciální prognostický marker; vysoká exprese tohoto genu u CLL buněk koreluje s přítomností nemutovaného genu pro IGHV a kratší dobou přežívání bez terapie. Analýza genové exprese pomocí kvantitativní RT-PCR dále identifikovala set genů (LAG3, LPL, ZAP70), jehož vysoká exprese identifikuje nemutovaný IGHV s 90 % specificitou. Vysoká exprese testovaného setu genů predikuje přežívání bez terapie rovnocenně s přítomností nemutovaného IGHV genu. Navrhovaný set genů umožňuje rychlé testování leukemických buněk se srovnatelnou prognostickou váhou jako má mutační status genu pro IGHV jako takový. Na základě našich výsledků je nyní vyvíjena komerční testovací sada s uplatněním při stanovování prognózy u onemocnění CLL v klinické praxi.

Abstract:

The study of the genome, transcriptome and proteome in the whole complexity led to the improvement of so called “high-throughput“ technologies. These analysis enable to study large amount of different molecules and their interactions at the same time. DNA microarrays are one of those technologies. DNA microarrays enable to analyse gene expression of thousands of genes and thus compare complete expression profiles of the cells. DNA microarrays are therefore often used for analysis of the malignant cells. They have been successfully used for classification of different tumor subtypes on the molecular level, they can contribute to the elucidation of the cancer pathogenesis or even define groups of patients with diffetent answer to the therapy or prognosis. The aim of this study was to introduce DNA microarray analysis into our laboratory and to use it to study gene expression analysis of the chronic lymphocytic leukemia malignant cells. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a lymphoproliferative disease characterised by a monoclonal expansion of mature B-lymphocytes. Mutational status of the immunoglobulin genes coding for heavy chain variable region (IGHV) stratifies patients suffering CLL into two distinct prognostic groups. We performed microarray analysis of CLL cells in order to detect the most important gene expression differences regarding IGHV status. We have also compared expression profiles of CLL cells and B-cells of healthy donors. Microarray gene expression analysis of CLL cells and B-cells from healthy donors was performed using Agilent Human Oligo1A (v2) Arrays. Comparing gene expression of normal and malignant B-cells we confirmed some previously published data, i. e. up-regulation of oncogene WNT3 in CLL or down-regulation of ptoto-ocogen LMO2. In case of CLL subgroups with different IGHV several tens of diferentially expressed genes were detected. High expressions of LPL, ZAP70 and LAG3 genes were the most prominently associated with unmutated IGHV subtype. The mRNA levels of selected genes (LAG3, LPL, ZAP70, AICDA, BCL2, CLLU1, TCF7, SEPT10) were further tested using quantitative RT-PCR. The selection came up partly from results of our microarray analysis and partly was based on literature. We detected Lymphocyte-Activation Gene 3 (LAG3) as a novel prognostic marker; high expression of LAG3 in CLL cells correlates with unmutated IGHV and reduced treatment-free survival (TFS). Furthermore, qRT-PCR analysis identified a gene-set (LAG3, LPL, ZAP70), overexpression of this gene-set is assigned to unmutated IGHV with 90 % specificity. Moreover, high expression of tested gene-set and unmutated IGHV equally correlated with reduced TFS. Our results suggest that IGHV mutational status can be precisely assessed using expression analysis of LAG3, LPL and ZAP70 genes, as the expression data of tested markers provides similar statistical concordance with TFS as IGHV mutational status itself. There is a comercial testing kit based on our results being developed to be used in routine CLL prognosis assesment.

Keywords

Chronická lymfocytární leukemie, DNA čipy, genová exprese, prognostické markery

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 10. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 20. 12. 2010
• Supervisor: prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology (4-years) / Oncology