Úloha m6A modifikace RNA v regulaci genové exprese

Helena Covelo Molares, Ph.D.

Doctoral thesis

The role of m6A modification in the regulation of gene expression

Abstract:

Modifikace a procesování RNA jsou základními kroky eukaryotické biogeneze mRNA. Jakmile molekula pre-mRNA opustí výstupní kanál RNA polymerázy II, přidá se k jejímu 5' konci čepička. Během sestřihu jsou poté vyštěpeny introny a exony se spojí do molekuly mRNA. Poslední krok transkripce zahrnuje štěpení a následnou polyadenylaci 3' konce mRNA. Během transkripce mohou být také modifikovány vnitřní nukleotidy. Jednou z nejlépe prozkoumaných modifikací nukleotidů mRNA je N6-methyladenosin (m6A), u kterého bylo prokázáno, že reguluje alternativní sestřih, export mRNA, translaci nebo degradaci. Na úvod tato disertační práce shrnuje současné znalosti o funkci modifikace m6A během života mRNA. Následně jsou představeny publikované výsledky o roli RNA demetylázy v expresi genů savců. Ukázali jsme, že se FTO váže do intronických oblastí pre-mRNA a jeho demetylační aktivita se podílí na regulaci alternativního sestřihu. Abychom získali vhled do protein-proteinových interakcí FTO, stanovili jsme si za cíl charakterizovat jeho transientní a stabilní interaktom. Studii jsme rozšířili na všechny další známé proteiny regulující hladiny m6A a N6-2'-O-dimethyladenosinu (m6Am) v lidských buňkách. Tyto výsledky jsou prezentovány formou rukopisu předloženého k publikaci. Souběžně s mými hlavními projekty jsem spolupracovala na dvou stále probíhajících projektech. Dosud získané předběžné výsledky jsou shrnuty v posledních kapitolách této disertační práce. První projekt se zabývá úlohou m6Am během rané neurální diferenciace buněk. Cílem druhého projektu je vytvoření pracovního protokolu pro přesnou detekci a kvantifikaci modifikací mRNA pomocí kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií.

Abstract:

RNA processing and modification are essential steps of mRNA eukaryotic biogenesis. As soon as the precursor mRNA leaves the exit channel of RNA polymerase II, a 5' cap modification is added to the nascent molecule. Intronic sequences are removed and exons are joined together by the splicing machinery. The final step of transcription involves cleavage and subsequent polyadenylation of the mRNA 3' end. Besides, internal canonical nucleotides can be modified during transcription. Among all modifications found in mRNA, N6-methyladenosine (m6A) has been shown to regulate alternative splicing, mRNA export, translation or decay. This Ph.D. thesis starts summarizing the current knowledge of the function of m6A modification during mRNA life. Then, I present our published results on the role of the RNA demethylase FTO in mammalian gene expression. We have shown that FTO binds intronic regions of pre-mRNAs and that FTO demethylation activity regulates alternative splicing. Next, to gain insights into the protein network of FTO we set the goal of characterizing the transient and stable interactome of FTO. We extended the study to all the other known proteins that regulate m6A and N6-2'-O-dimethyladenosine (m6Am) levels in human cells. These results are presented in the form of the submitted manuscript for publication. In parallel, I was involved in two collaboration projects which are still ongoing. The preliminary results obtained so far are summarized in the last chapters of the thesis. One project investigates the role of m6Am during early neural differentiation and the other one aims to establish a working protocol to accurately detect and quantify mRNA modifications by liquid chromatography coupled to mass spectrometry.

Keywords

m6A, m6Am, modifikace RNA, RNA metyltransferáza, RNA demetyláza, alternativní sestřih, BioID, neurální diferenciace, LC-MS/MS, RNA modification, RNA methyltransferase, RNA demethylase, alternative splicing, neural differentiation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 11. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 8. 12. 2020
• Supervisor: doc. Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D.
• Reader: prof. Vjačeslav Jurčenko, Ph.D., Mgr. Libor Krásný, PhD.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biomolecular chemistry and bioinformatics / Biomolecular chemistry and bioinformatics