Farmaka ve vodním prostředí a jejich vliv na ryby

MSc. Viktoriia BURKINA

Doctoral thesis

Pharmaceuticals in the aquatic environment and their effects in fish

Abstract:

In this thesis, the impact of atenolol, verapamil, dexamethasone, clotrimazole, and PBSA on the physiological condition and health of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) were studied in vivo and in vitro. The sub-chronic test of atenolol, including at the environmentally relevant concentration, demonstrated that only the fish exposed to atenolol at a concentration of 1000 ?g?L-1 may be at a higher risk of oxidative stress. The second pharmaceutical compound studied was an L-type calcium channel blocker, verapamil. Despite the relatively high concentration of verapamil included in the experiments, the rates of seven hepatic CYP450-mediated reactions (EROD, MROD, PROD, BFCOD, COH, and PNPH) were unchanged in the exposed rainbow trout. This indicates that the activities of the selected CYP450 enzymes were not affected. Exposure to the highest concentration of PBSA (1000 ?g?L-1) led to significantly inhibited glutathione reductase activity. The activities of the EROD, MROD, and PROD enzymes gradually increased, beginning at the environmentally relevant concentrations. We suggest that long-term exposure to PBSA could cause oxidative stress in fish, as indicated by the decreased activity of GR. Moreover, PBSA could interact with intracellular receptors due to the elevated activities of CYP1A (EROD and MROD) and CYP2B (PROD). Rainbow trout showed multiple responses after exposure to clotrimazole. Changes in the haematological parameters in the exposed rainbow trout suggested that the immune system and haemoglobin synthesis were affected. The antioxidant defence enzymes that responded to the clotrimazole exposure influenced the oxidative stress status of the fish. Sub-chronic exposure to clotrimazole did not lead to oxidative stress in any of the fish tissues studied, as indicated by the unchanged TBARS levels. Hepatic energetic pathways were activated in the tested groups after 42 days of exposure to clotrimazole. High levels of glutathione S-transferase were seen in the liver and gill tissues, possibly associated with the detoxification of clotrimazole. The interaction of clotrimazole with intracellular receptors can be expected due to the changes in the catalytic activities of CYP1A1 and CYP3A. The BCF levels in the muscle tissue suggest a moderate bioaccumulation of CLO. The relatively long elimination period for CLO in the fish kidney (half-life = 29 days) may imply a greater potential for adverse effects in this organ. This finding is significant in view of the structural disturbances that appeared in the kidney and testis. The changes observed in the kidney were most prominent in the tubular epithelial cells. Changes in the gonads were only visible in the male specimens, and the pathological changes in the testis may indicate a disruption of steroidogenesis. The potential of clotrimazole and dexamethasone to inhibit CYP450 enzyme activity in rainbow trout hepatic microsomes was investigated in vitro. Clotrimazole non-competitively inhibited EROD activity in the hepatic microsomes, while BFCOD activity was competitively inhibited. PNPH activity was only slightly reduced in the presence of clotrimazole, indicating that it does not significantly interact with CYP2E1. The presence of dexamethasone in the incubations did not affect any of the CYP450 enzymes investigated. Everything considered, the results of the study confirmed that the presence of clotrimazole in the environment is of concern with respect to its impact on the health status of fish. In this thesis, the data of the actual effects of several PPCPs on fish were discussed. Based on the response of selected molecular endpoints, the cardiovascular and anti-inflammatory drugs studied do not present a significant risk for fish, while the antifungal drug and UV-screening agent that were tested may disrupt several physiological processes in fish.

Abstract:

Tato práce se zabývá in vivo a in vitro studiem vlivu atenololu, verapamilu, dexamethasonu, clotrimazolu a PBSA na fyziologický stav a zdraví pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss). Subchronický test zahrnující environmentálně relevantní koncentrace atenololu prokázal, že vyšší riziko vzniku oxidativního stresu je pouze u ryb vystavených působení atenololu v koncentraci minimálně 1000 ?g L-1. Druhým studovaným léčivem byl verapamil, blokátor kalciových kanálů typu L. Přes relativně vysoké koncentrace verapamilu zahrnuté do experimentu, nebyla u exponovaných pstruhů duhových zjištěna změna úrovně žádné ze sedmi jaterních reakcí zprostředkovaných enzymatickým systémem CYP450 (EROD , MROD , PROD, BFCOD , COH a PNPH). Tyto výsledky naznačují, že aktivita vybraných CYP450 nebyla verapamilem ovlivněna. Vliv PBSA ze skupiny UV filtrů byl na rybách testován v sub-chronickém testu. Expozice nejvyšší koncentraci PBSA (1000 ?g L-1) vedla k významné inhibici aktivity glutathionreduktasy (GR). Aktivita EROD, MROD, PROD se zvyšovala v závislosti na koncentraci PBSA postupně od environmentálně relevantních koncentrací. Snížená aktivita GR naznačuje, že dlouhodobé působení PBSA může u ryb zvýšit oxidativní stres. Na základě zjištění zvýšené aktivity CYP1A (EROD a MROD) a CYP2B (PROD) je možné předpokládat interakce PBSA s intracelulárními receptory. U pstruha duhového byla zjištěna po vystavení clotrimazolu řada fyziologických poruch. Změny hematologických parametrů exponovaných ryb naznačují, že u pstruha duhového došlo k ovlivnění imunitního systému a poruchám syntézy hemoglobinu. Antioxidační obranné enzymy také reagovaly na expozici clotrimazolu, a tím ovlivnily oxidativní stav exponovaných ryb. Nezměněná úroveň TBARS ve všech studovaných tkáních ryb sub-chronicky exponovaných clotrimazolu nepotvrdila oxidativní poškození lipidů. U ryb exponovaných 42 dnů clotrimazolu byla zjištěna aktivace jaterních energetických drah. Vysoká aktivita glutathion-S-transferasy byla zjištěna v játrech a žábrách, tedy v orgánech pravděpodobně spojených s detoxikačními procesy clotrimazolu. Na základě zjištěných změn v katalytické aktivitě CYP1A1 a CYP3A lze očekávat interakce clotrimazolu s intracelulárními receptory. Úroveň biokoncentračního faktoru (BCF) ve svalové tkáni naznačuje mírný bioakumulační potenciál clotrimazolu. Relativně vysoký poločas rozpadu clotrimazolu v rybích ledvinách, téměř 29 dnů, představuje větší potenciál pro nepříznivé působení na tento orgán. Toto zjištění je důležité s ohledem na strukturální změny zjištěné histologickým vyšetřením ledvin a varlat. Změny pozorované v ledvinách byly nejvýraznější u tubulárních epitelových buněk. Histologické změny gonád byly viditelné pouze u samců, přičemž patologické změny varlat mohou způsobit narušení steroidogeneze. Potenciál clotrimazolu a dexamethasonu inhibovat činnost enzymatické skupiny CYP450 v jaterních mikrozomech byl u pstruha duhového zkoumán také pomocí in vitro experimentu. Clotrimazol způsobil v jaterních mikrozomech pstruha duhového nekompetitivní inhibici aktivity EROD. BFCOD aktivita byla clotrimazolem inhibována kompetitivně. PNPH aktivita byla za přítomnosti clotrimazolu snížena jen mírně, což naznačuje fyziologicky nevýznamnou interakci clotrimazolu s CYP2E1. Přítomnost dexamethasonu neovlivnila žádné studované enzymy CYP450. V souhrnu výsledky této studie potvrdily, že přítomnost clotrimazolu v životním prostředí je znepokojující, pokud jde o jeho dopad na zdravotní stav ryb. Tato práce shrnuje aktuální údaje o účincích některých PPCP na ryby. Studovaná kardiovaskulární a protizánětlivá léčiva nepředstavují na základě odezvy vybraných molekulárních markerů významn

Abstract:

é riziko pro ryby, zatímco testované fungicidní léčivo a UV filtr mohou u ryb narušit řadu fyziologických procesů.

Keywords

Biochemické markery, Jaterní mikrosomy, Cytochromy P450, Pstruh duhový, Biokoncentrace, Metabolismus, Farmaka.

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 9. 2014

Accessible from:: 9. 9. 2014

Thesis defence

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery