In vitro mikropropagace a protoplastové kultury u vybraných druhů čeledi fabaceae

Bc. Michal KNITL

Master's thesis

In vitro micropropagation and protoplast cultures for selected species of family fabaceae

Abstract:

Cílem diplomové práce bylo stanovit vhodné postupy pro mikroporpagaci a protoplastové kultury 6 genotypů - Lathyrus clymenum ATC81087, Lathyrus clymenum NS-01, Lathyrus ochrus ATC81371, Lathyrus neurolobus 20080542, Pisum fulvum WL 2140 a Pisum elatius JI 1794. Pro účely povrchové sterilizace byly použity komerční přípravky chloramin B (2,5% a 5%) a SAVO (36%). Pro zkrácení internodií byl testován Alar 85 (1,5 mg/l) a médium OK100 (1 mg/l BAP; 1 mg/l IBA). Jako bazální médium bylo při mikropropagaci použito médium MS doplněné růstovými regulátory. Kontrolním médiem bylo médium OK (0,01 mg/l BAP; 0,01 mg/l IBA). V multiplikační fázi mikropropagace byla u genotypů Lathyrus clymenum NS-01, Lathyrus ochrus ATC81371, Pisum fulvum WL 2140 a Pisum elatius JI 1794 použita média B1 (1 mg/l BAP), B2 (2,5 mg/l BAP), B5 (5 mg/l BAP) a B10 (10 mg/l BAP). Nejlepší zmnožení bylo u genotypu Lathyrus clymenum NS-01 na médiu B5 (3,7 na explantát). Při izolaci protoplastů genotypů Lathyrus clymenum NS-01, Lathyrus ochrus ATC81371 a Pisum elatius JI 1794 byly testovány enzymatické roztoky ENZ 1 (1% celuláza R-10; 0,1% pektolyáza Y23; 0,3% macerozym R-10), ENZ 2 (1% celuláza R-10; 0,1% pektolyáza Y-23; 0,9% macerozym R-10) a ENZ 3 (2% celuláza R-10; 0,1% pektolyáza Y-23; 1,5% macerozym R-10). U enzymatického roztoku ENZ 2 zvýšila preplazmolýza hustotu (o 2,63 3,24 x 10 5 protoplastů na 1 ml média) a životnost protoplastů (o 29,63 33,92 %). Jako plazmolytické a promývací roztoky byly použity PGly a CPW13. Pro stanovení optimální doby působení enzymatického roztoku byly testovány časy 14 h, 16 h a 18 h. Pro kultivaci získaných protoplastů byla testována média Y (2 mg/l BAP; 1 mg/l 2,4-D; 1 mg/l glutaminu) a Z (1 mg/l BAP; 0,2 mg/l NAA) s bazálním médiem MS doplněným o 90 g/l mannitolu a 30 g/l sacharózy.

Abstract:

The aim of this master thesis was to define appropriate proceedings for micropropagation and protoplast cultures of 6 genotypes - Lathyrus clymenum ATC81087, Lathyrus clymenum NS-01, Lathyrus ochrus ATC81371, Lathyrus neurolobus 20080542, Pisum fulvum WL 2140 and Pisum elatius JI 1794. For surface sterilization were tested a commercial agents chloramin B (2,5% a 5%) and SAVO (36%). Influence of growth retardant Alar 85 (1,5 mg/l) and medium OK100 (1 mg/l BAP; 1 mg/l IBA) for reduction of length of explants internode. As basal medium for micropropagation was used MS medium suplemented with growth regulators. Medium OK (0,01 mg/l BAP; 0,01 mg/l IBA) was used as control. In multiplication stage of the micropropagation were used media B1 (1 mg/l BAP), B2 (2,5 mg/l BAP), B5 (5 mg/l BAP) and B10 (10 mg/l BAP) for explants of genotypes Lathyrus clymenum NS01, Lathyrus ochrus ATC81371, Pisum fulvum WL 2140 and Pisum elatius JI 1794. Best result was obtained for genotype Lathyrus clymenum NS-01 on médium B5 (3,7 for explant). Enzymatic sotions ENZ 1 (1% celuláza R-10 ; 0,1% pektolyáza Y23; 0,3% macerozym R-10), ENZ 2 (1% celuláza R-10 ; 0,1% pektolyáza Y-23; 0,9% macerozym R-10) and ENZ 3 (2% celuláza R-10 ; 0,1% pektolyáza Y-23; 1,5% macerozym R-10) were tested for protoplast isolation of genotypes Lathyrus clymenum NS01, Lathyrus ochrus ATC81371 and Pisum elatius JI 1794. Influence of preplasmolysis on density (was higher for 2,63 3,24 x 10 5 protoplasts) and lifespan (was higher for 29,63 33,92 %) of protoplasts with use of enzymatic solution ENZ 2 was tested. As plazmolytic and washing solutions were used PGly and CPW13. Optimalization of enzymatic solution influence time was tested with times 14 h, 16 h and 18 h. For cultivation of protoplasts were tested media (2 mg/l BAP; 1 mg/l 2,4-D; 1 mg/l glutamin) and Z (1 mg/l BAP; 0,2 mg/l NAA) based on basal mediu MS suplemented with 90 g/l mannitol and 30 g/l sucrose.

Keywords

mikropropagace, Lathyrus spp., Pisum spp., Fabaceae, protoplastové kultury

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 8. 2015

Accessible from:: 6. 8. 2015

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Božena Navrátilová, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / BI-GEO