Hemato-nervová a likvor-nervová bariéra ve spinálních gangliích v normě a po poškození periferního nervu

MUDr. Marek Joukal, Ph.D.

Doctoral thesis

Blood-nerve and cerebrospinal fluid-nerve barrier of the dorsal root ganglia in normal conditions and after peripheral nerve injury

Abstract:

Úvod. Po poškození periferního nervu dochází k buněčným a molekulárním projevům neurozánětu nejen ve spinálních gangliích odpovídajících poškozenému nervu, ale také v gangliích vzdálených místu poškození. K šíření signalizace těchto změn může docházet na základě propojení míšních segmentů interneurony nebo krevní cestou. Cílem disertační práce bylo studium hemato-nervové a likvor-nervové bariéry ve spinálních gangliích. Navíc jsme chtěli ověřit hypotézu o možném šíření signálních molekul likvorem, které by tak mohly proniknout až ke spinálním gangliím přímo nesouvisejících s poškozeným nervem. Metody. Studium cévního zásobení jako součást hemato-nervové bariéry spinálních ganglií bylo uskutečněno 3D rekonstrukcí řezů s imunohistochemickou detekcí satelitních gliových buněk a kapilár. Na polotenkých řezech byla vyhodnocena plocha cévních profilů intaktních zvířat a 3 nebo 21 dnů po poškození nervu. Ultrastruktura kapilár spinálních ganglií byla studována elektronovým mikroskopem. Dynamika změn prostupnosti hemato-nervové bariéry spinálních ganglií intaktních zvířat a po poškození nervu byla studována intravenózní aplikací značeného dextranu (Fluoro-emerald) s cirkulací 30 minut, 5 a 18 hodin. Dosah subarachnoidálního prostoru na spinální ganglia byl studován intrathékální aplikací methylenové modře a imunohistochemickou detekcí arachnoidey protilátkou proti DPP-IV. Intrathékální aplikací Fluoro-emeraldu byla studována prostupnost likvor-nervové bariéry spinálních ganglií. Buňky spinálních ganglií obsahující značený dextran byly charakterizovány metodami nepřímé imunohistochemie protilátkami proti ED1, ED2, MHC-II a GFAP. Výsledky. Po poškození nervu byla pozorována aktivace satelitních gliových buněk a proliferace kapilár v ipsilaterálních spinálních gangliích potkanů přežívajících 3 i 21 dnů. Kapiláry tvořily „hnízda“ okolo neuronů, z nichž vybíhaly tenké linie tvořené endoteliemi doprovázející výběžky satelitních gliových buněk. Na polotenkých řezech byl po poškození nervu zjištěn signifikantní nárůst plochy cévních profilů zvyšující se s délkou poškození nervu. Na elektronogramech byly pozorovány profily cév se souvislým endotelem probíhající paralelně s osou ganglia. Endotelové buňky byly od satelitních gliových buněk odděleny zřetelnou vrstvou kolagenních fibril. Fluoro-emerald se po intravenózní aplikaci nacházel v makrofázích, satelitních gliových buňkách, v malých a středních neuronech spinálních ganglií. Došlo k postupnému nárůstu počtu aktivovaných makrofágů vyplněných dextranem v ipsilaterálních gangliích v závislosti na délce poškození nervu. Subarachnoidální prostor dosahoval na spinální ganglion ve formě slepého výběžku. Intrathékální aplikací značeného dextranu jsme prokázali přímou komunikaci likvoru se spinálními ganglii. Závěr. Poškozením nervu došlo k proliferaci kapilár a zvětšení plochy cévního řečiště v ipsilaterálních ganglií v rozsahu, který přímo úměrně odpovídal délce poškození nervu. Prokázali jsme také přímou komunikaci subarachnoidálního prostoru se spinálními ganglii, ke které pravděpodobně dochází mezi kořeny spinálních nervů a v místě přechodu dorzálního kořene ve spinální ganglion. Z našich výsledků lze předpokládat, že signální molekuly se mohou šířit z distálního pahýlu poškozeného nervu do krevního oběhu, následně změněnou hemato-nervovou bariérou spinálních ganglií do jejich intersticia a dále likvorem do vzdálených struktur centrální nervové soustavy.

Abstract:

Introduction. The cellular and molecular changes after peripheral nerve injury occur not only in dorsal root ganglia related to injured nerve but also in ganglia of the remote spinal segments. The spread of inflammatory reaction alongside the neuroaxis could be performed via interneurons or blood stream. However the signaling molecules can be spread also via the cerebrospinal fluid and then reach the dorsal root ganglia of remote spinal segments. Methods. The study of blood-nerve barrier of dorsal root ganglion was performed using 3D reconstruction of cryostat sections with immunohistochemical detection of satellite glial cells and capillaries. The area of vascular profiles was studied on the thick sections of intact rats and chronic constriction injury (CCI) operated animals with 3 or 21 days of survival. The ultrastructure of dorsal root ganglion capillaries was visualized on the thin sections under electron microscope. The dynamics of blood-nerve barrier leakage of intact and CCI-operated animals was studied using intravenous injection of fluorochrome conjugated dextran (Fluoro-emerald) with 30 minutes, 5 or 18 hours of blood circulation. The position of subarachnoid space in relation to the dorsal root ganglion was visualized by intrathecal injection of methylene blue and immunohistochemical detection of arachnoid with DPP-IV antibody. The permeability of cerebrospinal fluid-nerve barrier of dorsal root ganglia was studied by intrathecal application of Fluoro-emerald. The cells loaded with Fluoro-emerald were stained using indirect immunohistochemical detection with ED1, ED2, MHC-II and GFAP antibodies. Results. The activation of satellite glial cells and proliferation of capillaries was found in ipsilateral dorsal root ganglia of animals both 3 and 21 days after CCI. The capillaries formed nest-like formations around neurons and their branches followed satellite glial cells. The significant increase of vasular profile area was found on thick sections of ipsilateral dorsal root ganglia after CCI. The electron microscopy of thin sections revealed continuous capillaries in the dorsal root ganglia of all groups of animals and the endothelial cells were divided from the satellite glial cells by thin layer of collagen fibres. We found the Fluoro-emerald in macrophages, satellite glial cells and neurons of dorsal root ganglia after intravenous injection. The number of Fluoro-emerald positive macrophages increased following the time of CCI. Subarachnoid space reached the dorsal root ganglia and formed blind recess. Places of the direct communication amongst the cerebrospinal fluid and dorsal root ganglia were found between the spinal roots, and in the angle between dorsal root ganglion and dorsal root. The Fluoro-emerald was found after intrathecal injection in macrophages, satellite glial cells and neurons of dorsal root ganglia. Conclusions. The peripheral nerve injury caused neovascularization and increased capillary area in the ipsilateral dorsal root ganglia. We found the direct communication between the subarachnoid space and dorsal root ganglia. Our results suggested that the signaling molecules can reach the dorsal root ganglion via the altered blood-nerve barrier and then the molecules can affect the remote dorsal root ganglia as well as structures of central nervous system via cerebrospinal fluid.

Keywords

Spinální ganglia, hemato-nervová bariéra, likvor-nervová bariéra, chronický útlak nervu, subarachnoidální prostor, Fluoro-emerald, imunohistochemie Dorsal root ganglia, blood-nerve barrier, cerebrospinal fluid-nerve barrier, chronic constriction injury, subarachnoid space, immunohistochemistry

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 3. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 9. 6. 2016
• Supervisor: prof. RNDr. Petr Dubový, CSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Anatomy, Histology and Embryology (4-years) / Anatomy, Histology and Embryology