Detekce a lokalizace estrogenových receptorů během funkčního vývoje kančích spermií a v pohlavních orgánech kanců

MVDr. Romana Krejčířová

Doctoral thesis

Estrogen receptors detection and localization during the boar sperm functional development and in the boar reproductive organs

Abstract:

Estrogeny jsou steroidní hormony, které v organizmu samic i samců ovlivňují široké spektrum fyziologických funkcí. Účinek podobný přirozeným estrogenům mají i environmentální estrogeny dostávající se do organizmu z vnějšího prostředí. Podmínkou účinku přirozených estrogenních hormonů i environmentálních estrogenů je přítomnost specifických estrogenových receptorů v cílových tkáních.V současné době jsou známé tři estrogenové receptory. Klasické jaderné receptory ERα a ERβ účinkují zejména jako transkripční faktory, ale v odborné literatuře existují také informace o jejich lokalizaci v plazmatické membráně. Později byl objeven 7-transmembránový receptor GPER, který je považován za prostředníka při rychlé estrogenové negenomické signalizaci.Estrogenové receptory ERα a ERβ byly nalezeny v reprodukčním traktu i ve spermiích mnoha živočišných druhů. Absence estrogenových receptorů může mít za následek poruchy spermatogeneze. Publikované výsledky týkající se detekce a lokalizace estrogenových receptorů ERα i ERβ v reprodukčních tkáních a spermiích jsou velmi různorodé. Rozdíly jsou způsobené mezidruhovými odlišnostmi, věkem sledovaných jedinců, ale i různými variantami použitých metod či volbou specifických protilátek. Informace o detekci a lokalizaci membránového receptoru GPER jsou v dostupných odborných zdrojích velmi omezené.Cílem naší práce bylo zjistit expresi a lokalizaci membránového estrogenového receptoru GPER a klasických estrogenových receptorů ERα a ERβ v samčích reprodukčních orgánech prasete a v epididymálních i ejakulovaných spermiích a mapovat změny v distribuci jednotlivých typů estrogenových receptorů v zárodečných buňkách a spermiích kanců během jejich vývoje, zrání a po absolvování kapacitace a akrozomální reakce.Expresi receptoru GPER jsme prokázali v Leydigových buňkách a stočených kanálcích varlete a v sekrečním epitelu kanálku v nadvarleti. Výrazný signál pro tento receptor jsme detekovali i u spermií přítomných v lumen kanálku nadvarlete. V epididymálních spermiích izolovaných z hlavy, těla a ocasu nadvarlete jsme GPER detekovali zejména v akrozomu a v bičíku. Receptor GPER jsme lokalizovali i u kapacitovaných spermií v oblasti akrozomu a slabě i v bičíku, u spermií po akrozomální reakci byl slabý signál pouze v bičíku. Souběžnějsme prokázali i expresi proteinu GPER v extraktech z reprodukčních tkání i z epididymálnícha ejakulovaných spermií.Přítomnost receptoru ERα jsme prokázali v intersticiální tkáni varlat a ve spermiíchuvnitř lumen semenotvorných kanálků. V nadvarleti jsme ERα detekovali v sekrečním epitelua ve spermiích v kanálku nadvarlete zejména v jeho ocasu. U epididymálních spermiíizolovaných z jednotlivých úseků nadvarlete kanců podle dostupných zdrojů klasickéestrogenové receptory popsány nebyly. My jsme prokázali receptor ERα u epididymální kančíspermie v postakrozomální části a v ekvatoriálním segmentu hlavičky a ve střední části bičíku.V ejakulovaných spermiích bylo protilátkové značení ERα detekováno v akrozomální apostakrozomální oblasti hlavičky a ve střední části bičíku. Prokázali jsme rovněž proteinreceptoru ERα v extraktu z tkání varlat a nadvarlat odpovídající jeho zkráceným formám.Receptor ERβ byl detekován v bazální membráně semenotvorných kanálků varlat i u spermiív jeho lumen. V hlavě nadvarlete ERβ detekován nebyl, v těle a ocasu nadvarlete byl signál proERβ detekován v sekrečním epitelu a bazální membráně, spermie v lumen byly pozitivní proERβ pouze v ocasu nadvarlete. U ejakulovaných spermií byl signál pro ERβ zachycenv akrozomální části hlavičky spermie. V proteinovém extraktu z tkání a epididymálních iejakulovaných spermií byly proká

Abstract:

zány zkrácené formy receptoru ERβ.Poznatky o receptoru GPER jsou s výjimkou jeho detekce u ejakulovaných spermiízcela nové. Zjištění týkající se klasických receptorů ERα a ERβ doplňují dosud publikovanoupaletu výsledků, vykazují částečnou shodu s již publikovanými pracemi a akcentují rolizvolených metodických postupů jako možnou příčinu existující nejednotnosti dosudpublikovaných informací o ERα a ERβ u kanců. Získané výsledky ukazují, že lokalizaceve tkáni varlete a nadvarlete dospělých kanců i ve spermiích během jejich vývoje, může býtdůkazem účasti estrogenů prostřednictvím receptorů a rychlých negenomických reakcí vevývoji spermií i jejich posttestikulární maturaci.

Abstract:

Estrogens are steroid hormones that affect a wide range of physiological functions inthe female and male organisms. Moreover, there are environmental estrogens which havesimilar effect. A condition for the effect of natural estrogen hormones and environmentalestrogens is the presence of specific estrogen receptors in target tissues.Three estrogen receptors are currently known. The classical nuclear receptors ERα andERβ act in particular as transcription factors, but there is also information on their localizationin the plasma membrane in the literature. The 7-transmembrane receptor GPER has beendiscovered later, which is considered to be mediator in rapid estrogen non-genomic signaling.Estrogen receptors ERα and ERβ were found in the reproductive tract and in thespermatozoa of many animal species. Absence of estrogen receptors can result inspermatogenesis failure. Published results on the detection and localization of ERα and ERβestrogen receptors in reproductive tissues and spermatozoa are very diverse. Differences aredue to interspecies differences, the age of the studied individuals, but also variants of themethods used or the choice of specific antibodies. Information on the detection and localizationof GPER membrane receptors is very limited in available research resources.The aim of our work was to investigate the expression and localization of membraneestrogen receptor GPER and classical estrogen receptors ERα and ERβ in the male reproductiveorgans, epididymal and ejaculated spermatozoa of pig, and to map changes in distribution ofindividual types of estrogen receptors in boar germ cells and spermatozoa during theirdevelopment, and after capacitation and acrosome reaction.Expression of the GPER receptor was demonstrated in Leydig cells and seminiferoustubules and in the secretory epithelium of the epididymal tubule. Significant signal for thisreceptor was also detected in spermatozoa in the lumen of the epididymal tubule. In epididymalspermatozoa isolated from the head, body, and tail of the epididymis GPER was detectedespecially in acrosome and flagella. The GPER receptor was located in capacitated spermatozoain the acrosome and weakly in the flagella, in the sperm after the acrosome reaction there wasonly a weak signal in the flagella. We also demonstrated GPER expression in extracts fromreproductive tissues as well as from epididymal and ejaculated spermatozoa.The presence of the ERα receptor was shown in the interstitial tissue of the testis and in the sperm cells within the lumen of the seminiferous tubules. In the epididymis, ERα were detected in the secretory epithelium and spermatozoa within lumen of tubule, especially in the tail of epididymis. In epididymal spermatozoa isolated from the individual segments of boarepididymis, according to available literature, classical estrogen receptors were not described.We have demonstrated ERα receptor in boar epididymal spermatozoa in the posta-acrosomalpart and in the equatorial segment of the head and in the midpiece of the flagella. In ejaculated spermatozoa, the ERα antibody labeled the acrosomal and posta-acrosomal region of the head and the midpiece. We have also demonstrated the ERα receptor protein in the testicular andepididymal tissue extracts corresponding to its truncated forms. The ERβ receptor was detected in the basal membrane of the seminiferous tubules and in the lumen. There was no ERβ detected in the head of boar epididymis, in the body and tail ERβ was found in the secretory epitheliumand the basal membrane. Spermatozoa in the lumen of epididymal tubule was positive for ERβ only in tail of the epididymis. In ejaculated spermatozoa, the signal for ERβ was found in the acrosomal part of the sperm head. Protein extract from tissues and epididymal and ejaculated spermatozoa showed truncated forms of ERβ receptor.The findings of the GPER receptor are unique except for its detection in ejaculated spermatozoa. Our findings regarding classic

Abstract:

al ERα and ERβ receptors complete the results of the authors available in published research articles and emphasize the role of selected methodologies as a factor of the divergence of previously published information on ERα and ERβ in boars. The obtained results indicate that localization in the tissue of the testes and epididymis of adult boars and spermatozoa during their development may be evidence of estrogens involvement via their receptors and rapid non-genomic reactions in sperm development and their post-testicular maturation.

Keywords

estrogenové receptory, epididymální spermie, kančí testes

Keywords

estrogens receptors, epididymal sperm, boar testes

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 9. 2018

Thesis defence

• Supervisor: doc. MVDr. Radko Rajmon, Ph.D.
• Reader: Michal Ješeta, externi, Věra Jonáková, externi, Jana Antalíková, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme / field:
Animal Science / General Animal Science