Study on Certain Enzymes of the Degradation Metabolism of Polyamines

Jana Stránská

Doctoral thesis

Abstract:

Ornithine delta-aminotransferase (OAT, EC 2.6.1.13) catalyzes the transamination of L-ornithine to L-glutamate-gamma-semialdehyde. It has been found in mitochondria of human beings, animals, plants and microorganisms. The physiological role of OAT in plants is related to arginine catabolism resulting in glutamate and to biosynthesis of proline - osmolyte, which is known to play an important role in adaptation processes of plant cells to drought and salinity stress. In initial phases of my Ph.D. study, methods of OAT detection and activity assays were optimized. OAT activity was measured in plants (bean, mung bean and pea) using an appropriate homogenization method. The most suitable material for OAT isolation was found to be pea. OAT was partially purified using precipitation techniques, low-pressure and fast protein liquid chromatography. The final enzyme had a specific activity of 30 pkat/mg, an enrichment factor of 43 and a yield of 51 %. However, the sample still contained many impurities and OAT represented only a minor fraction of all proteins. At this point, it was decided to perform recombinant expression of pea OAT. First, a cDNA coding for PsOAT (OAT from pea - Pisum sativum, deposited in the EMBL/GenBank database under the accession code EU414030) was cloned and expressed in Escherichia coli to obtain a recombinant protein with a C-terminal 6xHis tag. Recombinant PsOAT was purified under native conditions by immobilized metal affinity chromatography and its molecular and kinetic properties were characterized. Protein identity was confirmed by peptide mass fingerprinting after proteolytic digestion in gel. Recombinant PsOAT (its purification resulted in a specific activity of 26,2 nkat/mg, an enrichment factor of 7,7 and a yield of 46,8 %) existed as a monomer of 50 kDa and showed typical spectral properties of enzymes containing pyridoxal-5'-phosphate as a prosthetic group. The cofactor content of PsOAT was estimated to be 0.9 mol per mol of the monomer by a spectrophotometric analysis with phenylhydrazine. The enzyme had a basic optimal pH of 8.8 and displayed relatively high thermal stability (T50 = 58 °C). An optimal temperature for ornithine transamination was 43 °C. L-Ornithine was the best substrate (Km = 15 mM) but PsOAT also slowly converted Nalpha-acetyl-L-ornithine. In these reactions, 2-oxoglutarate was the exclusive amino group acceptor (Km = 2 mM). Diamines and polyamines were not accepted as substrates. Conversely, 1,3-diaminopropane, putrescine, spermine, spermidine and norspermidine represented non-competitive inhibitors with millimolar inhibition constants (Ki) being at the same concentration level like the Michaelis constant (Km) for L-ornithine. The most potent non-competitive inhibitors were diethylenetetramine and triethylenetetramine. L-Norvaline was the only competitive inhibitor

Abstract:

Ornithin-delta-aminotransferasa (OAT, EC 2.6.1.13) katalyzuje reakci transaminace L-ornithinu na gamma-semialdehyd L-glutamátu. Vyskytuje se v mitochondriích živočichů, člověka, rostlin i mikroorganismů. Fyziologická role OAT v rostlinách souvisí s katabolismem argininu vedoucího k syntéze glutaminu a s biosyntézou prolinu - mj. osmolytu známého svou důležitou úlohou při adaptaci rostlinných buněk na sucho a salinitní stres. V prvních fázích doktorského studia byly optimalizovány metody detekce a stanovení aktivity OAT. Za pomoci vhodné homogenizační metody byla měřena aktivita enzymu v rostlinách (fazole, fazole mungo, hrách). Vhodným rostlinným materiálem pro izolaci OAT byl hrách. OAT byla částečně purifikována za použití technik precipitačních, nízkotlaké a střednětlaké kapalinové chromatografie. Výsledný enzym měl specifickou aktivitu 30 pkat/mg, stupeň přečištění 43 a výtěžek 51 %. Vzorek však stále obsahoval nečistoty a OAT představovala pouze malý podíl zbylých proteinů. V tomto bodě bylo rozhodnuto o provedení rekombinantní exprese hrachové OAT. Nejprve byla cDNA kódující PsOAT (OAT z hrachu - Pisum sativum, uloženo v databázi EMBL/GenBank pod přístupovým kódem EU414030) klonována a exprimována v Escherichia coli. Výsledkem byl rekombinantní protein s polyhistidinovou kotvou na C-konci. Rekombinantní PsOAT byla purifikována za nativních podmínek pomocí chelatační chromatografie a byly stanoveny její molekulové a kinetické vlastnosti. Identita proteinu byla potvrzena peptidovým mapováním po proteolytickém štěpení v gelu. Přečištěná PsOAT (specifická aktivita 26,2 nkat/mg, stupeň přečištění 7,7 a výtěžek 46,8 %) existuje jako monomer o molekulové hmotnosti 50 kDa a vykazuje typické spektrální vlastnosti enzymů obsahujících pyridoxal-5'-fosfát jako prostetickou skupinu. Obsah kofaktoru v PsOAT byl určen spektrofotometrickou analýzou s fenylhydrazinem jako 0,9 molu na 1 mol monomerního enzymu. PsOAT má bazické pH optimum (8,8) a vykazuje poměrně vysokou teplotní stabilitu (T50 = 58 °C). Optimální teplota pro transaminaci ornithinu je 43 °C. L-ornithin je jediný vhodný substrát PsOAT (Km = 15 mM), avšak enzym pomalu katalyzuje i přeměnu Nalfa-acetyl-L-ornithinu. Při těchto reakcích slouží jako akceptor aminoskupiny výhradně 2-oxoglutarát (Km = 2 mM). Diaminy a polyaminy nepůsobí jako substráty, naopak např. 1,3-diaminopropan, putrescin, spermin, spermidin a norspermidin představují nekompetitivní inhibitory s milimolárními inhibičními konstantami (Ki) na stejné úrovni, jako je Michaelisova konstanta (Km) pro L-ornithin. Nejsilnějšími nekompetitivními inhibitory jsou diethylenetetramin a triethylenetetramin. Jediným nalezeným kompetitivním inhibitorem je L-norvalin

Keywords

ornithine delta-aminotransferase, L-ornithine, 2-oxoglutarate, pyridoxal 5'-phosphate, proline

Keywords

ornithin-delta-aminotransferasa, L-ornithin, 2-oxoglutarát, pyridoxal-5'-fosfát, prolin

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 21. 6. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 21. 6. 2010
• Vedúci: Marek Šebela
• Oponent: Pavel Peč, Jan Lochman

Univerzita Palackého

Přírodovědecká fakulta

Doctoral programme / odbor:
Biochemie / Biochemie