Biosenzorová analýza nápojů

Miodrag Milovanović, M.Sc.

Doctoral thesis

Biosensors for analysis of drinks

Anotácia:

Práce popisuje spojení mezi geografickými a společenskými aspekty vína na jedné straně a profilem zastoupených karboxylových kyselin na straně druhé. Široce je rozpracována role slunce a „terroir“ na kvalitu hroznů a vína. Pojem „terroir“ zahrnuje půdu, topografii a klima a má významný vliv na kvalitu vinných hroznů a vína. Vinaři mají mnoho možností, jak pěstebními podmínkami zvyšovat kvalitu vína. Po dozrání hroznů začínají vznikající víno ovlivňovat společenské aspekty, prvním z nich s přímým vlivem na víno je technologie. Existuje mnoho postupů výroby vína, a tak je volba výrobní technologie hlavním bodem, kde se na víně jeho výrobce podepíše. Dalšími společenskými faktory s významným vlivem na víno jsou turistika a ekonomie. Všechny tyto faktory přímo ovlivňují složení karboxylových kyselin ve víně. Práce se proto zaměřuje na jejich stanovení pomocí biosensoru jako inovativního nástroje vhodného pro jejich charakterizaci. Jako vedlejší výstup práce je prezentováno také stanovení antioxidační aktivity v ovocných vínech. Pro přípravu ovocných vín s či bez přidaného cukru jsou využívány různé ovocné poldy – maliny, ostružiny, aronie, borůvky, jablka a třešně. Standardními i alternativními metodami bylo analyzováno 14 vzorků ovocných vín. Standardní metody jako je vysokoúčinná kapalinová chromatografie s reverzní fází (RP-HPLC) a hmotnostní spektrometrie (MS) s trojitým kvadrupólem (TQ) sloužily ke kvalitativní i kvantitativní analýze ale významným faktorem jsou zde náklady na potřebnou instrumentaci. Alternativními metodami použitými pro měření antioxidační aktivity byly FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power), DPPH (zhášení radikálu 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylu) a zkouška Folin-Ciocalteu, které jsou rychlejší a levnější než standardní metody. Standardní a alternativní metody poskytly uspokojivou shodu výsledků. Antioxidační aktivita jednotlivých vzorků ovocných vín odpovídala očekávanému rozmezí. V práci jsou popsány senzory použitelné jako náhrada lidského nosu a jazyka, tzv. elektronický a bioelektronický nos a jazyk. Jsou zde rozpracovány principy, návrh a metody pro sestrojení (bio)elektronického nosu a jazyka, také jsou uvedeny příklady jejich aplikace v různých odvětvích a perspektivy do budoucna. Tato část výzkumu se soustředila na vývoj enzymatického bioelektronického jazyka pro měření karboxylových kyselin pomocí inhibice enzymu sarkosin oxidasy a je prezentována v kapitole o využití enzymů v analýze vína. Příprava bioelektronického jazyka sestává z vytvoření kopolymerního síta (ekvimolární směs o-fenylendiaminu a resorcinolu) a vrstvy enzymu sarkosin oxidasy. Stejný přístup je použit také pro přípravu tříkanálového bioelektronického jazyka využívajícího laktát oxidasu, sarkosin oxidasu a kombinaci sarkosin oxidasy s fumarasou. Měření je založeno na amperometrické detekci peroxidu vodíku produkovaného v enzymatických reakcích. Bylo otestováno 31 vzorků vín. Pro stanovení hladiny karboxylových kyselin (mající vztah k jablečno – mléčnému kvašení) byla kromě této nově vyvinuté alternativní metody využita také kapilární elektroforéza (CE) jako standardní metoda. Obě metody detekce karboxylových kyselin byly poté chemometricky vyhodnoceny pomocí analýzy hlavních komponent (principal component analysis – PCA) a Kohonenovy samoorganizační mapy (self-organizing maps – SOM). Obě metody vykazovaly podobnost v rozdělení vzorků vín do jednotlivých skupin. Metoda SOM poskytovala lepší rozlišení vytvořených map než metoda PCA pro data získaná pomocí CE i bioelektronického jazyka. Tato nová metoda spojující bioelektronický jazyk s analýzou dat pomocí SOM by mohla sloužit jako nový způsob klasifikace vína.

Abstract:

This thesis shows the connection between the geographical and social aspects of wine in one hand and the profile of carboxylic acids from the other hand. The role of Sun and “Terroir” and their influence on the quality of grapes and wines are deeply presented. The term “Terroir” includes the soil, topography and climate, expressing a significant influence on grapes, wine and quality of the wine. There are many options for how producers can control the environment in order to enhance the wine quality. When the grapes have already matured the social aspect starts to influence the wine. The first social aspect which has a direct influence on wine is technology. There are many types of procedures on how to produce the wine because the technology is the first fingerprint of producers on wine. The tourism and economy as further social aspects have a significant influence on wine, as well. All these influences on wine have a direct link to the created carboxylic acids in wine. Due to this, the approach for the determination of carboxylic acids is focusing on the biosensor as an innovative tool for convenient characterization. The subject of investigation beside the grapes of wine, the determination of the antioxidant activity of fruit wine is presented in this thesis as a side activity. Various types of fruits such as raspberry, blackberry, chokeberry, blueberry, apple and cherries are prepared for vinification process with sugar and without sugar. The 14 fruit wine samples were analyzed by standard and alternative techniques for measurement. The standard methods were applied for quality and quantity detection and the equipment and servicing of these techniques are not cheap. These techniques are a reverse phase (RP) HPLC and means of the mass spectrometer (MS) with triple quadrupole (TQ) analyzer. The alternative methods for measuring the antioxidant activity are the ferric reducing/antioxidant power (FRAP), tha stability of free radical molecul 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and Folin–Ciocalteu assay. These methods are faster and cheaper than standard methods. The correctness of results in comparison with standard and alternative methods was satisfactory. The antioxidant activity of each fruit was expressed in the expected range. Sensors serving as a substitute of the human nose a tongue – electronic and bioelectronic nose and tongue are described. The designs, principles and the methods of (bio)electronic construction (nose and tongue, respectively) are mentioned. The direct applications in various fields are presented, as well. Moreover, the perspectives of both sensors are presented. The focus of this research was on developing the enzyme-based bioelectronic tongue for measurement of carboxylic acids by sarcosine oxidase enzyme inhibition effect. This focus is presented through the chapter of enzyme application in wine. The procedure of bioelectronic tongue preparation consists of creating the copolymer sieve (an equimolar mixture of o-phenylenediamine and resorcinol) with enzyme layer of sarcosine oxidase. This approach is used for preparing other bioelectronic tongue sensors such as lactate oxidase, sarcosine oxidase, and sarcosine oxidase / fumarase in the three sensing channels. The measurement is carried out by amperometric detection of hydrogen peroxide from the enzyme reactions. The 31 samples of grape wine were tested. Also, the standard method capillary electrophoresis (CE) and alternative (developed a bioelectronic tongue) was used for detection of carboxylic acids levels (indirectly related to malolactic fermentation). Both methods for detection of carboxylic acids were coupled to chemometrics methods as principal component analysis (PCA) and self-organizing maps (SOM). Both chemometrics methods have shown a good correspondence in presentation of the clusters of wine samples. The SOM treatment showed a better resolution of the generated patterns of wine samples than the PCA method for both CE and bio

Abstract:

electronic tongue data. The combination of bioelectrical tongue and SOM can be considered as a novel method in the classification of wine.

Keywords

Víno, Analýza vína, Organické kyseliny, Bioelektronický jazyk, Laktát oxidasa, Sarkosin oxidasa, Fumarát oxidasa, Kapilární elektroforéza, Analýza hlavních komponent, Kohonenova samoorganizační mapa, BioKarboxylová jednotka, QR klasifikace vína, Smart klasifikace vínaWine, Wine analysis, Organic acids, Bioelectronic tongue, Lactate oxidase, Sarcosine oxidase, Fumarase, Capillary electrophoresis, Principal components analysis, Self-organizing map, BioCarboxylic units, Quick Response wine classification, Smart wine classification

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 1. 8. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 30. 9. 2019
• Vedúci: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.
• Oponent: prof. RNDr. Libuše Trnková, CSc., doc. RNDr. Ludmila Zajoncová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry