Použití 2D-CN/SDS-PAGE ke sledování změn v zastoupení pigment-proteinových komplexů thylakoidních membrán stresovaných rostlin

Bc. Lukáš NOSEK

Master's thesis

Usage of 2D-CN/SDS-PAGE for determination of changes in pigment-protein complexes from thylakoid membranes of stressed plants

Abstract:

V práci se zabývám problematikou dvourozměrné nativní polyakrylamidové elektroforézy (PAGE) a její aplikace při studiu vlivu vysokoteplotního a světelného stresu na kompozici pigment-proteinových komplexů izolovaných z thylakoidních membrán. Teoretická část pojednává o přednostech a nedostatcích techniky bezbarvé nativní elektroforézy (CN-PAGE). Tato technika je v dnešní době široce používaným nástrojem pro separaci proteinových komplexů a její hlavní předností je možnost separace komplexů s vysokým stupněm intaktnosti. V teoretické části je dále pojednáváno o složení fotosystémů I a II, jejich funkci a především o vlivu vysoké teploty a vysoké intenzity světla na jejich kompozici. V experimentální části je pojednáno o separaci vysokomolekulárních pigment-proteinových komplexů thylakoidních membrán pomocí CN-PAGE (první rozměr) s následnou identifikací pomocí SDS-PAGE a MALDI-TOF nebo pomocí LC-MS/MS. Hlavním výsledkem je úspěšná separace superkomplexů s fotosystémem I a II a zhodnocení jejich stability při vysokoteplotním stresu. Při použití nízké koncentrace neiontového detergentu (dodecyl maltosidu) se podařilo pomocí této metody separovat superkomplexy s fotosystémem I, které obsahují podjednotky enzymu NAD(P)H:chinon-oxidoreduktasy.

Abstract:

I deal with problematics of two dimensional native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in this thesis and with it?s application for determination of impact of heat and light stress on composition of pigment-protein complexes from thylakoid membranes. The theoretical part discusses about advantages and disadvantages of the clear-native electrophoresis (CN-PAGE). This technique is nowadays widely used for separation of pigment-protein complexes and it?s main advantage is the possibility to remain the separated complexes in highly native state. In the theoretical part is further discussed about composition of photosystems I and II, their function and mainly about impact of high temperature and high intensity of light on their composition. The experimental part is focused on separation of high molecular-mass pigment-protein complexes from thylakoid membranes by CN-PAGE in first dimension with consequential identification of the subunits by SDS-PAGE and MALDI-TOF or by LC-MS/MS. The main result of this work is succesful separation of supercomplexes of photosystems I and II and assessment of their stability in high-temperature stress. Supercomplexes of photosystem I with NAD(P)H:quinone-oxidoreductase were obtained when low concentration of non-ionic detergent dodecyl-maltoside was used.

Keywords

Bezbarvá nativní elektroforéza, CN-PAGE, pigment-proteinové komplexy, thylakoidní membrány, vysokoteplotní stres, světelný stres, NAD(P)H, chinon-oxidoreduktasa, fotosystém I, fotosystém II, Hordeum vulgare

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 4. 2012

Accessible from:: 20. 4. 2012

Thesis defence

• Supervisor: Prof. RNDr. Petr Ilík, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry