Molekulární podstata evolučních změn telomer a telomeráz u rostlin

Mgr. Michal Závodník, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular nature of evolutionary changes of plant telomeres and telomerases

Abstract:

Tato práce je zaměřena na objasnění molekulární podstaty evolučních změn rostlinných telomer a telomeráz. Souvisí s jejich syntézou a faktory schopnými ovlivnit primární strukturu telomerových motivů syntetizovaných telomerázou. Telomeráza je ribonukleoproteinový komplex, jehož proteinová podjednotka s aktivitou reverzní transkriptázy (telomerázová reverzní transkriptáza, TERT) syntetizuje telomerové DNA repetice podle krátké části (templátové oblasti) RNA podjednotky – telomerázové RNA, TR. Od publikování první rostlinné telomerové sekvence (TTTAGGG)n v modelové rostlině Arabidopsis thaliana v r. 1988 byl tento telomerový motiv považován za „univerzální“ motiv pro všechny rostliny. Nicméně, po nějaké době začaly být objevovány rostliny postrádající tyto „typické“ rostlinné telomery. Prvními publikovanými výjimkami s neznámými telomerami byly rostliny řádu Asparagales, u kterého byly následně prokázány dvě evoluční změny sekvence telomer. První evoluční změna vedla k přechodu z původního rostlinného telomerického motivu (TTTAGGG)n na motiv (TTAGGG)n typický pro obratlovce. Druhá konverze na velmi dlouhý telomerický motiv (CTCGGTTATGGG)n byla zjištěna u rodu Allium. Objev tohoto velmi dlouhého motivu nám pak významně pomohl identifikovat první telomerázové RNA a zjistit jejich geny. Tyto znalosti tak způsobily revoluci v rychlosti a rozsahu identifikace rostlinných telomerázových RNA (TR) přímo z transkriptomických a genomických dat. Navíc jsme ukázali, že všechny tyto neobvyklé telomery jsou syntetizovány telomerázou. Tento nový systematický vyhledávací přístup byl pak v této práci hojně využíván. Na základě získaných dat z prohledání databází jsme identifikovali kandidátní TR napříč fylogenezí vyšších rostlin, včetně modelových rostlin, důležitých plodin a široké škály dalších rostlin. U mnoha rostlin s dříve neznámými telomerami jsme telomerové repetice popsali a zároveň jsme potvrdili i dříve publikované obvyklé i neobvyklé telomerové sekvence. Důležité je, že se ukázalo, že pravé telomerázové RNA napříč vyššími rostlinami mají monofyletický původ a že telomerové sekvence vždy odpovídají templátovým oblastem jejich příslušných telomerázových RNA. Tato práce pak nečekaně vedla i k identifikaci skutečné telomerázové RNA u A. thaliana (AtTR) a tím i ke stažení dříve publikovaného článku, který informoval o identifikaci nesprávné telomerázové RNA u A. thaliana (TER1). Přítomnost a funkčnost nově predikovaných telomerázových RNA a telomerických repetic jsme experimentálně testovali metodami běžně používanými v biologii telomer, jako jsou analýza terminálních restrikčních fragmentů (TRF) kombinovaná s testováním citlivosti TRF ke štěpení nukleázou Bal31, test na aktivitu telomerázy (TRAP) nebo fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Na základě těchto výsledků jsme mohli experimentálně ověřit neobvyklou telomerovou sekvenci (TTCAGGG)n u Ranunculus acris, Ranunculus repens a Papaver somniferum a telomerovou sekvenci (TTTCGGG)n u Delphinium consolida, Aconitum napellus, Erythranthe guttata a také u Fagopyrum esculentum. Kromě toho jsme pozorovali i častou přítomnost několika paralogů telomerázových RNA u rostlin, indikujících možnost syntézy více různých telomerových motivů. Například u rostlin Fagopyrum tataricum a Fagopyrum esculentum jsme pak TR paralogy experimentálně testovali. Na základě získaných i dřívějších poznatků jsme sestavili možný scénář průběhu evolučních změn telomerových sekvencí u rostlin. Tento scénář předpokládá jako první krok duplikaci genů pro TR, následnou sekvenční divergenci redundantních kopií TR a adaptivní evoluci telomer-vazebných proteinů. Tato práce tak propojuje exper

Abstract:

imentální výzkum s hypotézami evolučního vývoje ve větším měřítku, zahrnující i méně zkoumané rostliny. Výsledný pohled je uveden zde.

Abstract:

This work focuses on the elucidation of the molecular nature of evolutionary changes of plant telomeres and telomerases. It is connected to their synthesis and the factors capable of influencing the primary structure of telomere motifs synthesized by telomerase. The telomerase is a ribonucleoprotein complex, with a protein subunit possessing reverse transcriptase activity (telomerase reverse transcriptase, TERT) that synthesizes the telomeric DNA repeats according to a short segment (template region) of the RNA subunit – telomerase RNA, TR. Since the publication of the first plant telomere sequence (TTTAGGG)n in the model plant Arabidopsis thaliana in 1988, its telomere motif has been considered a "universal" motif for all plants. However, over time, plants lacking these “typical” plant telomeres began to be discovered. The first reported exceptions with unknown telomeres were plants of the order Asparagales. Subsequently, the two evolutionary changes of the telomere sequence were demonstrated within this order. The first evolutionary change led to the transition from the ancestral plant telomeric motif (TTTAGGG)n to the motif (TTAGGG)n, typical for vertebrates. The second conversion to a very long telomeric motif (CTCGGTTATGGG)n was reported in the genus Allium (Asparagales). The discovery of this very long motif significantly helped us to identify the first telomerase RNAs (TRs) and find out their genes. This knowledge thus revolutionized the speed and extent of plant telomerase RNAs (TRs) identification, directly from transcriptomic and genomic data. Moreover, we showed that all of these unusual telomeres are synthesized by telomerase. This new systematic search approach was then widely used in this work. Based on the data obtained from the search in databases, we identified candidate telomerase RNAs (TRs) across the phylogeny of higher plants, including model plants, important crops, and a wide range of other plants. We described the telomeric repeats in many plants with previously unknown telomeres, while we also confirmed previously published common and unusual telomere sequences in plants. Importantly, it was shown that the genuine telomerase RNAs across higher plants have a monophyletic origin, and the telomere sequences always corresponded to the template regions of their respective telomerase RNAs. Unexpectedly, this work then led to the identification of the genuine telomerase RNA in A. thaliana (AtTR) and thus to the retraction of the previously published article, which reported the identification of the incorrect telomerase RNA in A.thaliana (TER1). We experimentally tested the presence and functionality of the newly predicted telomerase RNAs and telomeric repeats by methods commonly used in telomere biology, such as terminal restriction fragment analysis (TRF), combined with the testing TRF susceptibility to cleavage by Bal31 nuclease, the telomerase activity assay (TRAP), or fluorescence in situ hybridization (FISH). Based on these results, we were able to experimentally verify the unusual telomere sequence (TTCAGGG)n in Ranunculus acris, Ranunculus repens, and Papaver somniferum, and the telomere sequence (TTTCGGG)n in Delphinium consolida, Aconitum napellus, Erythranthe guttata, and in Fagopyrum esculentum. In addition, we observed the frequent presence of several telomerase RNAs paralogues in plants, indicating the possibility of synthesis of multiple different telomere motifs. Subsequently, we tested these paralogues, for example in Fagopyrum tataricum and Fagopyrum esculentum. Based on the acquired and prior knowledge, we have compiled a possible scenario of the evolutionary changes of telomere sequences in plants. This scenario assumes, as its initial step, the duplication of the TR genes, followed by the subsequent sequence divergence of redundant TR copies, and the adaptive evolution of telomere-binding proteins. This work thus connects experimental research with hypotheses of large-scale evolution

Abstract:

ary development, even including less-studied plants. The resulting perspective is presented here.

Keywords

Telomeres, Telomerase, TERT, TR, Evolution, Gene duplication

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 9. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 27. 10. 2023
• Supervisor: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
• Reader: RNDr. Roman Hobza, Ph.D., doc. Mgr. Aleš Pečinka, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics