Involvement of reactive oxygen species in neutrophil extracellular traps formation

Marek BUZÁŠ

Bachelor's thesis

Abstract:

This bachelor thesis examines reactive oxygen species (ROS) generation and their effect on the differentiation of the promyelocytic human cell line HL-60 into neutrophils, neutrophil activation and neutrophil extracellular traps (NETs) formation. Neutrophil extracellular traps are web-like structures made of chromatin and proteins that allow neutrophils to trap and kill extracellular pathogens. ROS generation is a phenomenon associated with the differentiation of the HL-60 cell line into neutrophils and neutrophil extracellular traps formation, but the details remain unclear due to the difficulties connected with the detection of ROS in living systems. For our research, all-trans retinoic acid (ATRA) is used as a differentiating agent and phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) or lipopolysaccharides (LPS) as a stimulus. The concentrations of these agents, as well as the incubation times, appear to be crucial factors that influence the results. Superoxide anion radical formation is detected by electron paramagnetic resonance spin trapping using 2-ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide (EMPO) as a spin trap. Confocal laser scanning microscopy is utilized to observe the integrity of differentiated cells. The last part of our research focuses on protein analysis. Free radical modified protein adducts are identified by western blotting using anti-MDA (malondialdehyde) antibodies. Our findings may provide useful information on the involvement of free radicals and their adducts in NETs formation using HL-60 cell line as an in vitro model system. Exploring the regulatory role of protein adducts in NETs formation may support the development of new therapeutic methods in future.

Abstract:

Tato bakalářské práce se zabývá tvorbou reaktivních forem kyslíku (ROS) a jejich vlivem na diferenciaci promyelocytické lidské buněčné linie HL-60 na neutrofily, na aktivaci neutrofilů a na tvorbu neutrofilních extracelulárních pastí (NETs). Neutrofilní extracelulární pasti jsou síťovité struktury tvořené chromatinem a proteiny, které umožňují neutrofilům zachycovat a zneškodňovat patogeny. Tvorba ROS je jevem spojeným s diferenciací buněčné linie HL-60 na neutrofily a s tvorbou neutrofilních extracelulárních pastí. Nicméně detaily tohoto procesu nejsou zcela objasněné kvůli obtížnosti detekce ROS v živých systémech. V tomto výzkumu je jako diferenciační činidlo použita kyselina all-trans retinová (ATRA) a jako aktivační činidla jsou využity forbol-12-myristát-13-acetát (PMA) nebo lipopolysacharidy (LPS). Koncentrace těchto činidel, stejně tak jako inkubační doby, se ukázují býti důležitými faktory, které ovlivňují výsledky. Tvorba superoxidového anion radikálu je detekována pomocí elektronové paramagnetické rezonance s využitím spinové pasti 2-ethoxykarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrol-1-oxidu (EMPO). Ke sledování integrity diferenciovaných buněk je použita konfokální laserová skenovací mikroskopie. Poslední část našeho výzkumu se zaměřuje na proteinovou analýzu. Proteinové adukty modifikované volnými radikály jsou identifikovány pomocí SDS-PAGE a western blotu s použitím anti-MDA (malondialdehyd) protilátek. Naše poznatky mohou poskytnout důležité informace pro budoucí výzkum vlivu volných radikálů a jejich aduktů na tvorbu neutrofilních extracelulárních pastí za použití buněčné linie HL-60 jako in vitro modelového systému. Zkoumání regulační role proteinových aduktů při tvorbě neutrofilních extracelulárních pastí by v budoucnu mohlo dopomoci k vývoji nových terapeutických metod.

Keywords

Neutrofily, neutrofilní extracelulární pasti, reaktivní formy kyslíku, buněčná linie HL-60, buněčná diferenciace, kultivace buněk, kyselina retinová, lipopolysacharidy, forbol-12-myristát-13-acetát, elektronová paramagnetická rezonance, konfokální laserová skenovací mikroskopie, western blot

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2023

Thesis defence

• Supervisor: Renuka R. Manoharan, M.Sc., Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biotechnology and Genetic Engineering / Biotechnology and Genetic Engineering