Vývoj LC-MS metódy na stanovenie kolchicínu v ľudskej plazme

Mgr. Kristián Pršo, Ph.D.

Advanced ('rigorózní') thesis

Development of LC- MS method for determination of colchicine in human plasma

Abstract:

Colchicine is a secondary alkaloid metabolite naturally occurring in meadow safron (Colchicum autumnale) used in the treatment of gout, familial Mediterranean fever (FMF) and Behcet's disease. The drug has a narrow therapeutic index and acts as a mitotic toxin disrupting the spindle apparatus. A selective and sensitive high-throughput method was developed for colchicine detection and quantification in human plasma using liquid chromatography–tandem mass spectrometry. A one-step extraction procedure capable of protein precipitation and phospholipid removal using an OSTROTM was applied for sample pretreatment. Extracts were analysed by gradient elution followed by detection on a mass spectrometer operating in multiple reaction monitoring mode in a total time of 3.2 min. The method was validated according to the European Medicine Agency guideline over the concentration range of 0.05 – 100 ng/mL for colchicine. Validation parameters were selectivity, carry-over, linearity of calibration curves, the lower limit of quantification, precision and accuracy, matrix effects, extraction recovery, dilution integrity and stability, and the method was applied for colchicine quantification in samples from FMF patients. The method represents a sensitive tool for colchicine detection and quantification in biological samples with advantages such as low sample volume requirement (200 μL), one-step sample pretreatment, and a wide concentration range with a low limit of quantification and a high degree of selectivity.

Abstract:

Kolchicín je alkaloid prirodzene sa vyskytujúci v jesienke obyčajnej (Colchicum autumnale), ktorý je indikovaný v terapii dny, familárnej stredomorskej horúčky či Bechcetovej choroby. Má úzky terapeutický index a ovplyvňuje delenie buniek vo fáze mitózy, kde narúša funkciu deliaceho vretienka. Rigorózna práca pojednáva o vývoji selektívnej a citlivej metódy na jeho detekciu a kvantifikáciu v krvnej plazme, a to pomocou kvapalinovej chromatografie – tandemovej hmotnostnej spektrometrie. Plazma bola spracovaná jednoduchou metódou precipitácie bielkovín a odstránenia fosfolipidov v jednom kroku pomocou platničiek OSTROTM. V celkovom čase analýzy, predstavujúcom 3,2 minúty, bol extrakt separovaný použitím gradientovej elúcie a následne detegovaný hmotnostným spektrometrom operujúcim v móde monitorovania viacerých reakcií. Metóda bola validovaná podľa smernice Európskej agentúry pre lieky v koncentračnom rozmedzí 0,05 – 100 ng/ml. Validované parametre boli selektivita, prenos analytu medzi jednotlivými meraniami, linearita kalibračných kriviek, dolná medza stanovenia, presnosť a správnosť, matricové efekty, výťažnosť extrakčnej metódy, integrita vzorky po nariedení a stabilita analytov v plazme pri rôznych skladovacích podmienkach. Následne bola metóda použitá na stanovenie koncentrácií v plazme u pacientov s paroxyzmálnou peritonitídou. Analytická metóda v predkladanej rigoróznej práci predstavuje citlivý nástroj na detekciu a kvantifikáciu liečiva v biologickej vzorke. Vyznačuje sa výhodami ako potreba relatívne malého množstva vzorky (200 μl), jednoduché spracovanie so schopnosťou odstránenia fosfolipidov v jednom kroku, široké koncentračné rozmedzie s nízkou medzou detekcie a vysokým stupňom selektivity.

Kľúčové slová

kolchicín, kvapalinová chromatografia, tandemová hmotnostná spektrometria, ľudská plazma, colchicine, liquid chromatography, tandem mass spectrometry, human plasma

Jazyk práce: Slovak

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 3. 10. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 3. 4. 2024
• Vedúci: doc. PharmDr. Oldřich Farsa, Ph.D.
• Oponent: PharmDr. Jaroslav Maxa, PhD., doc. RNDr. Bc. Jiří Pazourek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Pharmacy

Advanced ('rigorózní řízení') programme / odbor:
Pharmacy / Pharmacy