Charakterizace procesů nezbytných pro zahájení embryonální genomové aktivace u preimplantačních embryí savců

Ing. Veronika Kinterová

Doctoral thesis

Characterization of processes necessary for the initiation of embryonic genome activation in mammalian preimplantation embryos

Abstract:

Časný preimplantační vývoj savců je řízen maternálními mRNA a proteiny, které byly nasyntetizovány již v průběhu oogeneze. Během časného vývoje jsou tyto rezervy postupně odstraňovány a nahrazeny jejich embryonálními formami. Zatímco degradace maternálních mRNA je postupný proces, který vrcholí v období okolo hlavní vlny aktivace embryonálního genomu (EGA), o degradaci maternálních proteinů není známo příliš mnoho informací. Jedním z nejpravděpodobnějších způsobů odstranění maternálních proteinů se jeví degradace pomocí ubiquitin – proteazomového systému (UPS). K tomu, aby byly proteiny odstraněny pomocí proteazomu, musí být nejprve označeny ubiquitinem (tzv. ubiquitinace). Na ubiquitinaci se podílí tři enzymové komplexy: E1, E2 a E3 enzymy. Výběr specifického cílového proteinu a finální navázání ubiquitinu je zprostředkováno pomocí E3 – ubiquitin ligáz.Tato práce se soustředila na detailní studium SCF komplexu (Skp1-Cul1-F-box), jedné z nejčastějších E3 ubiquitin-ligáz. SCF komplex se skládá ze tří neměnných složek: Cul1, Skp1, Rbx1 a jednoho zástupce z rodiny F-box proteinů, který určuje substrátovou specifitu. Nejprve jsme sledovali expresi mRNA a proteinů jednotlivých neměnných členů SCF komplexu. Počátek syntézy mRNA Cul1 a Skp1 byl detekován u embrya skotu již v 4buněčném a časném 8buněčném stádiu, což naznačuje nezbytnost těchto transkriptů pro přípravu embrya na EGA. Hladina proteinu CUL1 postupně vzrůstala od MII oocytů po stádium moruly a protein byl lokalizován především v jádrech, méně v cytoplazmě. Ve stádiu blastocysty byla sledována nižší intenzita signálu ve vnitřní buněčné mase (ICM) než v trofoektordermu (TE). Hladina proteinu SKP1 signifikantně vzrostla mezi MII a 4buněčným stádiem, následně však opět signifikantně poklesla. Tento protein byl lokalizován rovnoměrně rozprostřený v cytoplazmě, ve stádiu blastocysty s mírně nižší intenzitou v oblasti ICM. V hladinách proteinu RBX1 nebyl detekován žádný statisticky významný rozdíl, i jeho lokalizace v cytoplazmě byla po celý vývoj nezměněná. Aktivní SCF komplex, který je určen vazbou Cul1 na Skp1, byl rovnoměrně rozložen v průběhu celého preimplantačního vývoje. Ve stádiu blastocysty však byla jeho aktivita znatelně nižší v oblasti ICM než v oblasti TE.K inhibici SCF ligáz jsme použili MLN4924, což je inhibitor neddylací aktivovaných ligáz. Po kultivaci oocytů v tomto inhibitoru nedocházelo k expanzi kumulárních buněk, nicméně oocyty byly úspěšně in vitro oplozeny. Po oplození jsme však detekovali signifikantní nárůst polyspermie a i následující vývoj do stádia blastocysty byl zhoršený. Opožděný vývoj jsme nalezli i při využití inhibitoru MLN4924 ke kultivaci embryí od 4buněčného do pozdního 8buněčného stádia. U těchto embryí jsme detekovali snížené množství mRNA markerů EGA – PAPOLA a U2AF1, což naznačuje opožděnou aktivaci embryonálního genomu. Kultivace v MLN4924 vedla ke zvýšení celkového množství proteinů u ošetřených oocytů i embryí, u kumulárních buněk se podobný nárůst neprojevil. Pomocí metody western blot jsme sledovali hladinu následujících proteinů: SMAD4, ribozomální protein S6, centromerický protein E, P27, IκBA, RBM19 a ZAR1. Neobjevili jsme však žádný statisticky významný nárůst v jejich množství, který by značil jejich hromadění. U třech proteinů (P27, IκBA, SKP1) jsme při western blot analýze všech vývojových stádií nalezli bandy s vyšší molekulární hmotností, než bylo očekáváno. Tyto vyšší bandy pravděpodobně naznačují tvorbu komplexů, které mohou být pro preimplantační embrya specifické.Naše práce prokázala, že SCF ligázy jsou nepostradatelné pro správné zrání oocytů, expanzi kumulárních

Abstract:

buněk, oplození a časný preimplantační vývoj skotu.

Abstract:

The early preimplantation development is controlled by maternal mRNA and proteins synthetized during oogenesis. These reserves are gradually degraded and replaced by embryonic transcripts during early embryogenesis. The degradation of maternal mRNA is gradual process, which peaks around the major wave of embryonic genome activation (EGA), but mechanisms underlying the elimination of maternal proteins remains still unknown. One of the most likely way to eliminate maternal proteins seems to be ubiquitin – proteasome system (UPS). UPS-based protein degradation is managed by ubiquitin attached to the targeted protein (process called ubiquitination) by the cooperation of three enzymatic complexes: E1, E2 and E3 enzymes. E3 enzymes are responsible for protein specificity and final binding of ubiquitin to the target protein. These thesis is focused mainly on a detailed study of SCF (Skp1-Cul1-F-box) complex, one of the most common E3 ubiquitin-ligases. The SCF complex is composed by three invariant members: Cul1, Skp1, Rbx1 and one member from the F-box family, which determines the substrate specificity. At first, we observed the expression of mRNA and proteins of all three invariable members. Cul1 and Skp1 mRNA synthesis was detected at the four-cell and early eight-cell stage respectively, which suggests that these transcripts are necessary for preparing the embryo for EGA. CUL1 protein level increased gradually from MII oocytes to the morula stage embryos and protein was localized primarily to nuclei and to a lesser extent to the cytoplasm with a lower signal in the inner cell mass (ICM) compared to trofoectoderm (TE) at the blastocyst stage. The level of the SKP1 protein significantly increased from MII oocytes to four-cell stage embryos, but then significantly decreased again. The localization of the SKP1 protein was analysed throughout the cell and staining was less intensive in the ICM at the blastocyst stage. There were no statistical differences in RBX1 protein level and this protein was localized in cytoplasm during all preimplantation development without changes. The active SCF complex, which is determined by the interaction of Cul1 and Skp1, was found throughout the whole embryo during preimplantation development. The signal of active complex was less intense in the ICM than in the TE.After the SCF ligases inhibition by cultivation in MLN4924, inhibitor of neddylation controlled ligases, we found no cumulus cells expansion, however oocytes were able to be in vitro fertilized. After fertilization we detected significantly higher rate of polyspermy and deteriorated embryonic development. After treatment with MLN4924 from the four-cell to late eight-cell stage, we found a statistically significant delay in their development. We found reduced levels of mRNA of EGA markers – PAPOLA and U2AF1, which indicated delay in embryonic genome activation. The cultivation with MLN4924 caused a significant increase in protein levels in MLN4924-treated oocytes and embryos, no such change was found in cumulus cells. To detect, which proteins are affected by MLN4924 treatment, we performed western blot analysis of selected proteins: SMAD4, ribosomal protein S6, centromeric protein E, P27, IκBA, RBM19 and ZAR1. No statistically significant increase in protein levels was detected in either treated oocytes or embryos. However, we found bands of higher molecular weight than expected in three proteins (P27, IκBA and SKP1) after western blot analysis of all developmental stages. These higher bands can indicate complexing of proteins specific for preimplantation embryos. Our study showed that SCF ligases are necessary for the correct maturation of oocytes, cumulus cells expansion, fertilization, and early preimplantation development of cattle.

Keywords

preimplantační embrya, aktivace embryonálního genomu, degradace proteinů, ubiquitin – proteazomový systém, SCF komplex

Keywords

preimplantation embryos, embryonic genome activation, protein degradation, ubiquitin – proteasome system, SCF complex

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 10. 2019

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Eva Chmelíková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme / field:
Animal Science / General Animal Science