Mikrofluidické postupy pro přípravu vzorků, manipulace buněk a vícerozměrné separace

Mgr. Václavek Václavek, Ph.D.

Doctoral thesis

Microfluidic procedures for sample preparation, cell manipulation and multidimensional separations

Abstract:

Moderní analytické přístroje díky využití pokročilých a vysoce citlivých elektronických obvodů a součástek umožňují detekovat ve vzorku přítomnost i velice malého množství látek. Zároveň se zdokonalováním přístrojové techniky se stává velice důležitým směrem v analytické biochemii také miniaturizace dávkování vzorku. Miniaturizovaná analytická zařízení k manipulaci s malými objemy vzorků a reakčních činidel často využívají principů mikrofluidiky, vědního oboru zabývajícího se chováním a manipulací kapalin v mikroměřítku. Tato disertační práce popisuje vývoj i aplikace mikrofluidních analytických zařízení a biosensorů, přičemž zahrnuje různé mikrofabrikační postupy, mikrofrézování a metody 3D tisku. Podstatná část této práce se zabývá vývojem mikrofluidních nástrojů sloužících k analýze jednotlivých buněk. Za tímto účelem bylo vyvinuto mikrofluidní zařízení, díky kterému lze odseparovat jednotlivé buňky z buněčné suspenze do sprejovací kapaliny. Separace probíhá pomocí elektrických pulzů, které současně tyto buňky lyzují, aby následně mohly být lyzáty jednotlivých buněk analyzovány za použití nanosprejové ionizace a hmotnostní spektrometrie. S pomocí tohoto zařízení byly přímo detekovány alfa a beta řetězce hemoglobinu uvolněného z jediného erytrocytu. Dále bylo vyvinuto zařízení, které umožňuje počítat a zároveň určovat velikost částic i buněk v suspenzi proudící mikrokanálkem, využívající metody měření odporových pulzů, způsobených průchodem částice malým pórem. Zařízení bylo použito k detekci PC3 nádorových buněk prostaty v suspenzi s červenými krvinkami. V této práci je také popsána výroba mikrofluidních rozhraní sloužících pro spojení kapalinové chromatografie s kapilární elektroforézou a zařízení využívajícího principu kapénkové mikrofluidiky, umožňující monitorování enzymatické reakce probíhající v jednotlivých mikrokapénkách vody v oleji. Další řešenou problematikou jsou interdigitální zlaté mikroelektrody připravené k využití jako impedanční biosensory a vývoj miniaturizovaných průtočných i stacionárních cel, vyrobených pomocí mikrofrézování a 3D tisku.

Abstract:

Modern analytical instruments provide ultra-low detection limits and utilize advanced and highly sensitive electronics. In line with the instrumental advances, miniaturization of sample delivery is an essential direction in analytical biochemistry. To operate with minute volumes of samples or reagents, miniaturized devices frequently exploit principles of microfluidics, a science of fluid manipulation at the microscale. This dissertation describes the development and applications of microfluidic and biosensor analytical instruments, including microfabrication strategies, micro-milling, and 3D printing. A substantial part of this thesis was dedicated to developing microfluidic tools for single-cell analysis. A microfluidic device that integrates the single-cell extraction from cell suspension, electrical lysis, buffer exchange, and nanospray ionization for mass spectrometry analysis of intracellular compounds was developed. Its performance was demonstrated by directly detecting hemoglobin alpha and beta chains released from a single erythrocyte. Another device designed to analyze single cells was a microfluidic flow-through sensor for counting and sizing particles and cells by resistive pulse sensing, which monitors the current disruptions caused by particles passing through a narrow pore. This device was applied to detect PC3 prostate cancer cells within a population of red blood cells. This work also presents microfluidic devices for interfacing liquid chromatography with capillary electrophoresis or a device for monitoring enzymatic reactions based on droplet microfluidics. Interdigitated gold microelectrodes for biosensor applications using electrochemical impedance spectroscopy and miniature biosensor casings for measurements in flow-through or droplet format, manufactured by micro-milling and 3D printing, are described as well.

Keywords

analýza jednotlivých buněk, biosensor, hmotnostní spektrometrie, mikrofluidika, miniaturizace, snímání odporových pulzů, mass spectrometry, microfluidics, miniaturization, resistive pulse sensing, single-cell analysis

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 7. 6. 2022
• Supervisor: Ing. František Foret, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D., RNDr. Václav Kašička, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry