Zavedení sekvenační metody pro identifikaci mikroorganismů z enviromentálních vzorků

Bc. Pavlína Nekudová

Master's thesis

Introduction of a sequencing method for the identification of microorganisms from environmental samples

Abstract:

Diplomová práce se zabývá analýzou mikrobiální populace během kompostování potravinového odpadu pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Potravinový odpad představuje ekologický i ekonomický problém a je významným zdrojem kontaminace životního prostředí a potencionálních patogenů. Metody detekce mikroorganismů z environmentálních vzorků nejčastěji zahrnují kultivaci, která je ale časově náročná a většina mikroorganismů je nekultivovatelná. V této diplomové práci byla zpracována literární rešerše na problematiku potravinového odpadu a detekci mikroorganismů pomocí molekulárních metod s důrazem na PCR a sekvenaci. V rámci literární rešerše byla vypracována přehledová tabulka pro zacílení PCR umožňující panbakteriální detekci, kde cílovým genem byla malá ribozomální podjednotka bakteriálního genu 16S rRNA (ribozomální ribonukleová kyselina). V rámci experimentální práce byla navrhnuta a optimalizována panbakteriální PCR detekce cílená do konzervativních oblastí genu 16S rRNA. Nejprve byla provedena in silico analýza genu 16S rRNA napříč bakteriemi vyskytujícími se v půdě, potravinovém odpadu, kompostu nebo se jednalo o potencionální patogeny. Na základě toho byly navrhnuty primery pro panbakteriální detekci. Následně se optimalizovala vhodná koncentrace MgCl2 a dNTP. Jelikož vstupní koncentrace a kvalita DNA u environmentálních vzorků je často nízká, testoval se i vliv počtu cyklů na amplifikaci. Navržená detekce byla následně otestována na reálných vzorcích z potravinového odpadu. Výsledky ukázaly, že navrhnutá detekce je dostatečně citlivá pro identifikaci bakterií z environmentálních vzorků. Optimalizovaná metoda bude sloužit pro amplifikaci vzorků z potravinového odpadu pro následnou sekvenaci a identifikaci přítomných bakterií.

Abstract:

This thesis deals with the analysis of microbial populations during food waste composting using polymerase chain reaction (PCR). Food waste is an environmental and economic problem and a significant source of environmental contamination and potential pathogens. Methods for the detection of microorganisms from environmental samples most commonly involve cultivation, but this is time consuming, and most microorganisms are unculturable. A literature review was conducted on food waste and microbial detection using molecular methods, focusing on PCR, and sequencing. The review included a table of primers targeting the bacterial 16S rRNA gene. In the experimental part, a panbacterial PCR detection was designed and optimised. It targets conserved regions of the 16S rRNA gene. First, an in-silico analysis of the 16S rRNA gene was performed on bacteria found in soil, food waste, compost or which are potential pathogens. This was the basis for the design of primers for pan-bacterial detection. This was followed by optimisation of the appropriate concentration of MgCl2 and dNTP. The effect of the number of cycles on amplification was also tested, as the input concentration and DNA quality of environmental samples is often low. Finally, the detection system has been tested on real food waste samples. The results showed that proposed detection is sensitive enough to identify bacteria from environmental samples. The optimised method will be used for the amplification of food waste samples for subsequent sequencing and identification of the bacteria present.

Keywords

Potravinový odpad, Panbakteriální detekce, PCR, 16S rRNA

Keywords

Food waste, Panbacterial detection, PCR, 16S rRNA

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 5. 6. 2024
• Supervisor: Mgr. Eva Jansová, Ph.D.
• Reader: Adam Norek, externi

Mendel University in Brno

Faculty of AgriSciences

Master programme / specializace:
Molecular Biology and Biotechnology / Animal Molecular Biology and Biotechnology