Indukce buněčné smrti u nádorových buněk s inaktivovaným antionkogenem p53

Mgr. Soňa Čejková, Ph.D.

Doctoral thesis

Cell death induction in tumor cells with inactivation of tumorsuppressor p53

Abstract:

Abnormality tumor-supresorových genů TP53 a ATM výrazně zhoršují prognózu a výsledek léčby u pacientů s chronickou lymfocytární leukémií (CLL). Není zcela zřejmé, jaký důsledek má heterozygótní delece genu ATM (11q-) pro odpověď na konvenční terapii. V práci byla testována in vitro senzitivita CLL vzorků na nukleosidový analog fludarabin, jeho kombinaci s monoklonální protilátkou rituximab a alkylační látku chlorambucil a to u následujích genetických skupin: heterozygotní delece ATM, TP53-defekt (delece a/nebo mutace) a vzorků bez těchto defektů (wt). Analýza buněčné viability byla provedena prostřednictvím metabolického testu WST-1. Fludarabin a jeho kombinace s rituximabem byly testovány u následujících vzorků: 20 s mutací a/nebo delecí TP53, 21 s delecí ATM a 18 wt (celkové n=59). Chlorambucil byl testován u těchto vzorků: 11 s mutací a/nebo delecí TP53, 12 s delecí ATM a 14 wt. Aktivace dráhy ATM/p53 byla monitorována pomocí Western-blotu sledujícího hladinu a fosforylaci proteinu p53 a kvantitavní Q-RT-PCR monitorující indukci jeho cílových genů, tj. PUMA a BAX. Vzorky s TP53 abnormalitami vykazovaly značně vyšší resistenci jak k fludarabinu (P = 0.012) tak i k chlorambucilu (P=0,018) v porovnání s ostatními CLL vzorky, zatímco signifikantní rozdíl mezi vzorky s ATM delecí a vzorky wt nebyl pozorován ani pro fludarabin (P = 0.71) ani pro chlorambucil. Toto pozorování bylo v souladu i s podobnou stabilizací proteinu p53 a indukcí jeho cílových genů PUMA a BAX ve vzorcích s ATM delecí a wt. Podíl CLL vzorků senzitivizovaných rituximabem pro fludarabin byl o něco nižší u vzorků s TP53-defektem a ATM-delecí ve srovnání se vzorky wt (30%; 29%; 50%), avšak tento rozdíl nebyl statisticky významný (P=0.22). Přítomnost heterozygotní delece genu ATM (bez znalosti mutačního stavu druhé alely) by neměla být - na rozdíl od delece a/nebo mutace genu TP53 - považována za marker rezistence CLL buněk na fludarabin nebo chlorambucil.

Abstract:

Abnormalities of the, cooperating tumor-suppressor genes TP53 and ATM significantly deteriorate the prognosis and treatment options for chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients. It is not clear, what is the consequence of heterozygous ATM deletion for response of CLL patients to conventional therapy. The in vitro sensitivity of the CLL samples was tested to nucleoside analogue fludarabine, its combination with monoclonal antibody rituximab and alkylating agent chlorambucil, for the following genetic groups: with heterozygous ATM deletion, TP53 abnormality (deletion and/or mutation) and samples lacking these defects (wild-type). Cell viability was assessed using WST-1 assay. Fludarabin and its combination with rituximab were tested in the following samples: 20 with TP53 mutation and/or deletion; 21 with ATM deletion; 18 wild-type (n=59). Chlorambucil was tested in 11 samples with TP53 mutation and/or deletion, 12 samples with ATM deletion, and 14 wild-type (n=37). The activation of the ATM/p53 pathway was monitored using Western blot (monitoring level and phosphorylation of p53 protein) and real-time Q-RT-PCR (analyzing induction of p53-downstream targets, ie, PUMA and BAX). The TP53-abnormal samples exhibited markedly higher resistance to both fludarabine (p = 0.012) and chlorambucil (p=0,018) than the remaining CLL, while a significant difference between the ATM-deleted and wild-type subgroups was not observed (p = 0.71; p = 0.xx, respectively). This observation was in line with the similar induction of p53 protein and its downstream target genes PUMA and BAX in ATM-deleted and wild-type samples. The proportions of the samples which had been sensitized to fludarabine by the rituximab pre-treatment were insignificantly lower (p = 0.22) in the TP53-abnormal and ATM-deleted subgroups compared to the wild-type cases (30%; 29%; 50%, respectively). The presence of heterozygous ATM deletion (without knowledge of second allele mutation status) should not be considered a priori – by contrast to TP53 defects - as an indication of CLL cells resistance to fludarabine or chlorambucil.

Keywords

CLL, TP53, ATM, fludarabin, chlorambucil, rituximab

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 2. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 19. 3. 2013
• Supervisor: doc. Mgr. Martin Trbušek, Dr.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology (4-years) / Oncology