Genetic screen to identify new genes involved in plant reproduction

Darya Volkava, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Produkce semen je klíčovým faktorem určujícím úspěšnost zemědělské produkce, neboť přímo ovlivňuje výnos plodin a potravinovou bezpečnost. U kvetoucích rostlin tvorbě semen předchází meióza, specializované buněčné dělení, které probíhá v květních orgánech. Na konci meiózy buňky přecházejí z meiotického na mitotický program, aby vytvořily funkční gametofyt. Narušení tohoto procesu může ovlivnit tvorbu pylu a vézt ke snížení výnosu. U Arabidopsis thaliana řídí ukončení meiózy protein SMG7 inhibicí translace. Ztráta funkce SMG7 během samčí meiózy způsobuje aberantní jaderná dělení a vznik defektního pylu. Abych odhalila nové regulátory tohoto procesu, provedla jsem supresorový genetický screening s využitím hypomorfního mutanta smg7-6, který produkuje snížené množství životaschopného pylu a je částečně fertilní. V tomto screeningu bylo izolováno a analyzováno deset mutantních linií se zvýšenou fertilitou, což vedlo k identifikaci kandidátních genů spojených s buněčným cyklem, reakcí na stres, imunitní odpovědí a metabolizmem RNA. Pro podrobnou analýzu jsem se zaměřila na supresorovou linii, která nesla bodovou mutaci v genu CAP-D2, který kóduje podjednotku kondenzinu I. Tato mutace, označená jako capd2-2, obnovila fertilitu u rostlin smg7-6. Alelická varianta capd2-1, která inaktivuje tento gen, rovněž zlepšila fertilitu, ale způsobila závažné vývojové defekty, včetně zakrnělého růstu, špatné architektury kořenů a sníženého počtu chromocenter. Naproti tomu capd2-2 vykazovala normální vývoj rostlin při zlepšeném průběhu meiózy, což naznačuje mírnější, hypomorfní účinek. Je pozoruhodné, že mutace v jiných podjednotkách kondenzinu tento efekt na smg7-6 neukazovali, což podtrhuje specifickou roli CAP-D2. Tato zjištění naznačují, že částečné snížení aktivity CAP-D2 může zmírnit meiotické defekty u smg7-6, pravděpodobně modulací kondenzace nebo segregace chromozomů během samčí meiózy. V průběhu této práce jsem si všimla, že rostliny s narušenou produkcí semen často tvořily více květů než rostliny kontrolní. Abych tento fenomén dále prozkoumala, zahájila jsem genetický screening s cílem najít mutanty se zvýšenou produkcí květů a plodů. Avšak mechanizmy, které regulují množství květů se ukázaly být příliš komplexní na to, abychom je odhalili takovouto genetickou analýzou. Proto jsem se zaměřila na podrobný popis tohoto jevu a provedla detailní charakterizaci ukončení kvetení v životním cyklu Arabidopsis. Klíčovým pro reprodukční růstu rostlin je aktivita meristémů květenství (MK), což jsou malé shluky kmenových buněk na vrcholu stonku. U rostlin s neurčeným květenstvím, jako je Arabidopsis, je trvání aktivity KM určeno počtem květů, které rostlina vytvoří. Jakmile je dosaženo určitého prahu reprodukční produkce, KM zastaví svoji aktivitu a kvetení ustane. Jedna z hypotéz vysvětlující tento jev je, že vyvíjející se plody vyčerpávají z rostlin růstový faktor potřebný pro aktivity KM. Navrhli jsme, že tímto faktorem je fytohormon cytokinin. Tuto hypotézu jsme testovali pomocí kvantitativní mikroskopie KM a manipulací hladiny a distribuce cytokininů, abychom prozkoumali, jak je aktivita meristému regulována. Naše výsledky podporují model, podle kterého vyvíjející se plody odvádějí tok cytokininu z bazální části rostlin do meristému, čímž indukují jeho proliferativní zástavu. Dále jsme ukázali, že délka období kvetení a signalizace cytokininu v KM je ovlivněna dostupností dusičnanů, klíčového zdroje živin pro rostliny, široce používaného v hnojivech. To naznačuje, že cytokinin funguje jako systémový signál, který integruje informace o probíhající reprodukci a nutričním stavu rostliny za účelem regu

Anotace:

lace produkce květů. Souhrnně tato zjištění prohlubují naše porozumění tomu, jak genetické a hormonální dráhy regulují produkci semen. Pochopení mechanismů, které koordinují délku období kvetení, může přispět k tvorbě nových strategií pro zlepšení výnosu plodin a jejich reprodukční odolnosti.

Abstract:

Seed production is a key factor determining success of agriculture output, as it directly influences crop yield and food security. In flowering plants, seed formation follows meiosis, a specialised cell division that takes place in floral organs. A critical transition occurs at the end of meiosis, when cells switch from a meiotic to a mitotic program to form the gametophyte. Disruption of this transition can produce non-viable gametophytes and, ultimately, reduce yield. In Arabidopsis thaliana, the conserved protein SMG7 controls meiotic exit by inhibiting translation. Loss of SMG7 function in male meiosis causes aberrant nuclear divisions and non-viable pollen. To uncover novel regulators of this process, I conducted a forward genetic screen using a hypomorphic smg7-6 mutant that produce a reduced amount of viable pollen and is partially fertile. Ten high-confidence rescue lines were isolated and analysed, leading to the identification of candidate genes linked to cell cycle, stress, immune response, and RNA decay pathways. For detailed analysis, I focused on one suppressor line that harboured a point mutation in CAP-D2, a conserved non-SMC subunit of the condensin I complex. This mutation, designated as capd2-2, significantly restored fertility in smg7-6 plants. A T-DNA insertion allele, capd2-1, also improved fertility but caused severe developmental defects, including stunted growth, poor root architecture and reduced chromocenter numbers, consistent with a strong loss-of-function. In contrast, the capd2-2 showed normal plant development alongside improved meiotic progression, suggesting a milder, hypomorphic effect. Notably, mutations in other condensin subunits did not rescue smg7-6, underscoring a specific role for CAP-D2. These findings suggest that partial reduction of CAP-D2 activity can alleviate meiotic defects in smg7-6, possibly by modulating chromosome condensation or segregation during male meiosis. During the course of this work, I noticed that plants with impaired seed production often grew taller and produced more flowers than wild type. To investigate this apparent trade-off, I initiated a genetic screen in wild type Arabidopsis for mutants with enhanced fertility. However, the underlying developmental networks proved too complex for straightforward genetic dissection. I therefore focused on describing the phenomenon in detail and conducted an in-depth characterisation of the end-of-flowering phase in the Arabidopsis lifecycle. At the core plant reproductive growth lies activity of inflorescence meristems (IMs) — small clusters of stem cells at shoot tip. In plants with indetermined inflorescence, like Arabidopsis, duration of IM activity determines how many flowers a plant will produce. Once a threshold of reproductive output is reached, IMs undergo proliferative arrest and flowering ceases. We hypothesized that developing fruits act as sinks that deplete a shared growth-promoting factor needed by the IM and proposed the phytohormone cytokinin as this factor. We tested this idea by combining quantitative imaging of the IM with the manipulation of cytokinin levels and distribution to investigate how meristem activity is regulated. Our results support the model that developing fruits divert the acropetal flow of cytokinin away from the meristem, triggering its proliferative arrest. Furthermore, we show that the duration of flowering and cytokinin signaling in the IM is influenced by availability of nitrate, a crucial nutrient source for plants, widely used in fertilisers. This suggests that cytokinin functions as a systemic signal that integrates information about ongoing reproductive effort and plant nutrient status to control flower production. Together, these findings advance our understanding of how genetic and hormonal pathways regulate seed production. By uncovering mechanisms that coordinate fertility and flowering duration, this work contributes to strategies for improving crop yield and reproducti

Abstract:

ve resilience.

Keywords

Arabidopsis thaliana, plant reproduction, forward genetic screen, meiosis, condensin I, end of flowering, inflorescence meristem, cytokinin, nitrate.

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 8. 2025

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 4. 9. 2025
• Vedoucí: Mgr. Karel Říha, Ph.D.
• Oponent: prof. Mgr. Eva Frimlová, PhD., doc. RNDr. Jan Hejátko, Ph.D., Dr. Ortrun Mittelsten Scheid

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Vědy o živé přírodě / Vědy o živé přírodě